人巨細胞病毒感染與川崎病的相關性

喻莉莉，盧家程，薛向陽，仇慧仙，吳蓉洲，褚茂平

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童心臟中心 溫州醫科大學心臟發育與轉化醫學研究所，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 兒科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫科大學 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035）

川崎病（Kawasaki disease，KD）又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，是一種主要發生在5歲以下兒童的急性自限性疾病[1]。1967年在日本首次報道，多見于6個月至5歲的兒童，累及中等大小動脈，為急性炎癥性血管炎，冠狀動脈損害是其嚴重并發癥[2]。急性期未靜脈注射免疫球蛋白的兒童約20%會發展成為冠狀動脈瘤。KD已經取代了風濕熱成為發達國家兒童心臟病發病的主要原因[3]。KD具體發病機制尚不明確，但很多研究表明它是一種與感染相關的疾病。人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是皰疹類DNA病毒，屬β皰疹病毒，是一種普遍存在的病毒，正常人原發感染后會導致終生的潛伏感染，對免疫缺陷的患者造成嚴重的后果。該病毒幾乎侵襲所有器官，包括血管[4]。USTA等[5]和CATALANO-PONS等[6]也曾先后報道過KD伴發冠狀動脈損害患者中存在HCMV的感染，提示HCMV感染與KD的發生或其冠狀動脈損害有關。但目前針對HCMV感染在KD發生發展，尤其與KD并發癥冠狀動脈損害的相關性研究甚少。本研究通過分析臨床KD兒童HCMV感染情況，探索HCMV感染與KD發生及其進展，尤其是冠狀動脈損害發生的相關性。

1 資料和方法

1.1 回顧性分析資料 收集2005年3月至2013年12月溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院進行HCMV檢測的所有KD患者233例（KD組）的資料，其中男161例，女72例，年齡均＜5歲。KD診斷標準依據國內第八次川崎病討論紀要[7]：發熱5 d（抗生素治療無效，不能被其他已知疾病所解釋）或以上（含經治療5 d以內退熱情況），具備以下5項中4項者即可診斷為典型川崎病（complete Kawasaki disease，CKD）：①雙眼結膜充血；②口唇發紅、楊梅舌、口腔及咽喉黏膜彌漫性充血；③多形性紅斑、皮疹；④四肢末梢變化：（急性期）手足硬腫、掌趾及指趾端充血，（恢復期）指趾端甲床皮膚移行處膜狀脫皮；⑤急性期出現非化膿性頸部淋巴結腫脹；如具備除發熱以外3項表現并證實有冠狀動脈損害者，亦可診斷為CKD。不完全KD診斷標準：發熱≥5 d，具備2項以上KD臨床表現者，并具有炎癥反應指標明顯升高者，在除外其他疾病后，可疑診斷為不完全KD，若出現冠狀動脈改變，可確診為不完全KD。其中冠狀動脈損害標準：年齡≤3歲，冠狀動脈內徑＞2.5 mm；年齡4～9歲，冠狀動脈內徑＞3.0 mm；年齡＞9歲，冠狀動脈內徑＞3.5 mm；冠狀動脈局部內徑較鄰近處明顯擴大（≥1.5倍）。同時收集同一時期我院年齡、性別匹配的健康體檢兒童113例作為正常組，其中男67例，女46例，年齡均＜5歲；選取同一時期我院年齡、性別相匹配的門診發熱兒童143例作為發熱組，其中男97例，女46例，年齡均＜5歲。排除標準：①基本資料如年齡、性別未標注，或年齡＞5歲；②未標記檢測HCMV抗體是IgM或IgG的資料；③檢測樣本不是血液（如腦脊液、尿液、乳汁等）。由于部分兒童缺乏完整的臨床癥狀和血液學指標，相應指標例數不完全相同。本研究通過溫州醫科大學醫學倫理委員會批準。

1.2 驗證分析資料 收集2014年8月至2015年3月我院KD兒童58例，其中男39例，女19例，年齡均＜5歲，同時收集同時期我院年齡、性別匹配的健康體檢兒童40例以及住院發熱兒童40例的血清標本，所有的血清標本收集后于-80 ℃保存。

1.3 HCMV特異性IgM及IgG抗體檢測 采用瑞士羅氏公司HCMV IgM、IgG抗體檢測試劑盒（電化學發光法）通過cobase 601免疫分析儀檢測所有血清標本中HCMV特異性IgM及IgG抗體。HCMV IgM抗體檢測結果以臨界值指數（cut off index，COI）分別表示有反應性或無反應性。無反應性：COI＜0.7；不確定性：0.7≤COI≤1.0，有反應性：COI＞1.0。HCMV IgG抗體檢測效價無反應性：效價＜0.5 U/mL；不確定性：0.5 U/mL≤效價≤1.0 U/mL；有反應性：效價＞1.0 U/mL。樣本有反應性代表HCMV抗體陽性，無反應性代表HCMV抗體陰性，不確定性則需重新檢測。

1.4 臨床癥狀和血液指標 收集所有KD兒童的臨床癥狀，包括發熱、皮疹、眼結膜充血、口唇改變、四肢改變及淋巴結腫大等，以及血液指標，包括C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、白細胞計數（white blood cell count，WBC）、中性粒細胞計數（absolute neutrophil count，ANC）、淋巴細胞計數（lymphocytes，LY）、血小板計數（blood platelet，PLT）、紅細胞容積（red blood cell volume，HCT）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、白蛋白、冠狀動脈損害。

1.5 統計學處理方法 應用SPSS20.0軟件進行分析。計數資料采用χ2檢驗進行比較，再進行兩兩比較。計量資料符合正態分布時，以±s表示，2組間比較采用t檢驗；不符合正態分布時，以M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組兒童HCMV感染檢測的回顧性分析 回顧性分析結果顯示，發熱兒童的HCMV IgM陽性率明顯高于KD兒童與正常兒童（P＜0.05），而KD兒童與正常兒童間差異無統計學意義（P＞0.05）。3組間IgM抗體滴度水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。KD兒童、發熱兒童、正常兒童HCMV IgG陽性率和IgG滴度水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 回顧性分析的3組兒童HCMV IgM陽性率和滴度比較

表2 回顧性分析的3組兒童HCMV IgG陽性率、滴度比較

2.2 3組兒童HCMV感染檢測的驗證分析 驗證分析結果顯示，KD兒童、發熱兒童及正常兒童血清HCMV IgM陽性率和滴度水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。3組兒童血清HCMV IgG陽性率差異均無統計學意義（P＞0.05），但KD兒童血清HCMV IgG滴度水平明顯高于發熱兒童和正常兒童（P＜0.05）。見表3。

表3 驗證分析的3組兒童血清HCMV IgM、IgG陽性率、滴度比較

2.3 HCMV的既往和現癥感染對KD的影響 HCMV感染會引起血管病變，特別是冠狀動脈損害[8]，故本研究對KD兒童的HCMV感染及相對應的各臨床癥狀和血液指標進行分析。結果顯示，血清HCMV IgM陽性的KD兒童的LY高于IgM陰性的KD兒童（P＜0.05），其他血液學指標差異無統計學意義（P＞0.05）。血清IgM陽性的KD兒童冠狀動脈損害的發生比例明顯高于IgM陰性者（P＜0.05），而IgG陽性和IgG陰性的KD兒童冠狀動脈損害發生比例差異無統計學意義（P＞0.05）。血清HCMV IgG陽性和陰性KD兒童其他指標差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4-5。

3 討論

KD是一種多見于5歲以下兒童的自限性、發熱性疾病，主要為自身免疫性血管炎，主要侵犯中小動脈，特別是冠狀動脈。未經治療的KD患者中15%～25%的患者會出現冠狀動脈擴張或形成冠狀動脈瘤，從而導致缺血性心肌病或猝死[9]。KD的發病率有種族差異，日本發病率最高，5歲以下兒童每10萬個中有264.8個[2]，美國為每10萬個中有10～21個[10]。韓國的調查發現在2012至2014年的發病率依次為每10萬個兒童中有170.9、194.9、194.7個[1]。目前KD的致病因素及機制未明。病因可能是感染因子、環境毒素、遺傳因子或引起T細胞非特異性活化的超抗原[11]。YOSHIOKA等[12]在急性期KD患者的血清中發現抗鏈球菌發熱性外毒素C抗體明顯增加。有學者從死亡KD兒童的冠狀動脈血管壁中分離出一種可以識別病毒的IgA包涵體，并在死者的支氣管上皮細胞高表達，所以認為呼吸道病毒可能為KD常見病原體之一[13]。有研究表明KD組的總呼吸道病毒（腺病毒、腸病毒、鼻病毒和冠狀病毒）RNA與正常兒童相比明顯提高[14]。TURNIER等[15]發現192例KD患者41.9%為陽性呼吸道病毒感染，多數為鼻病毒/腸病毒。國內學者通過檢測KD兒童和正常兒童咽拭子的EBV-DNA，發現KD組的檢出率明顯高于正常組，得出EB病毒可能是KD的主要病原，EB病毒感染與KD密切相關[16]。

表4 KD兒童中HCMV IgM陽性與陰性兒童臨床癥狀及血液相關指標的比較

HCMV屬于人類β-皰疹病毒。新生兒感染HCMV可能導致危及生命的疾病，與神經發育和出生缺陷相關[17]。在健康、免疫能力強的個體中，HCMV感染主要是無癥狀的。持續或反復的免疫系統感染，如獲得性免疫缺陷綜合征患者或移植器官接受者可能會導致發病率和病死率顯著提高[18]。HCMV參與成人的一些動脈疾病，如動脈粥樣硬化、冠狀動脈再狹窄、動脈瘤和心臟異體移植血管病變[19]。

目前有關HCMV感染與KD相關性的研究很少，且MARCHETTE等[20]和LEE等[21]的研究也表明HCMV的感染不是KD的主要病因。KD形成的冠狀動脈瘤發現eNOS表達降低，而eNOS表達的降低可抑制NO的表達，最終導致內皮細胞及內皮組細胞功能紊亂[22-23]。SHEN等[24]的研究顯示HCMV感染可通過抑制AKT途徑抑制內皮細胞活力及eNOS表達。此外，VCAM-1和ICAM-1在KD患者中明顯升高[22]，HCMV亦可促進內皮細胞VCAM-1、ICAM-1的表達[25]。有報道提示除了KD會引起急性的冠狀動脈損害外，KD病史有可能是將來動脈粥樣硬化的危險因素[26]。故HCMV感染可能促進KD發生或其冠狀動脈損害。

本研究回顧性分析了KD兒童血清HCMV抗體水平，發現KD兒童IgG抗體的陽性率為73.36%，陽性率較高，但與正常兒童和發熱兒童比較，差異無統計學意義。IgM抗體代表現癥感染，發熱兒童IgM陽性率顯著高于KD兒童和正常兒童。IgG和IgM滴度水平均沒有差異，表明HCMV的既往感染或現癥不是KD的病因。國內一項研究通過檢測KD兒童血清RNA，也發現單純皰疹病毒感染率與發熱組無差異[27]。驗證分析結果與回顧性分析結果大體一致，3組兒童的血清HCMV IgG和IgM陽性率以及IgM滴度水平均無差異。但驗證分析結果發現，KD兒童的IgG滴度水平明顯高于發熱兒童和正常兒童，表明IgG滴度水平與KD的發生呈一定的相關，HCMV既往感染后的強免疫狀態可能促進KD的發生。關于驗證分析和回顧性分析在IgG滴度水平結果的差異，由于2次血清標本檢測的方法不同，得到的數值也有所差異。

綜合分析KD兒童臨床癥狀和血清指標發現，HCMV IgM陽性的KD兒童冠狀動脈損害的發生比例高于陰性兒童，提示KD兒童HCMV的急性感染可能會促進冠狀動脈損害的發生。HCMV IgG陽性的KD兒童冠狀動脈損害的發生比例與陰性兒童相近。這與鄧正銘[27]的研究吻合，他發現在KD兒童中，有病毒感染的冠狀動脈損害發生率高。有學者發現一個血清HCMV IgM陽性的KD兒童，其冠狀動脈發生擴張[5]。CATALANO-PONS等[6]報道了2例發展冠狀動脈瘤的原發感染HCMV的KD病例，提出HCMV感染在冠狀動脈瘤的發展中可能起推動作用，建議不完全KD兒童應檢測是否有HCMV感染。綜上，當兒童出現異常嚴重的HCMV感染時，需要留意冠狀動脈損害或冠狀動脈瘤的發生。血液學指標上IgM陽性的KD兒童的LY高于IgM陰性兒童，與其病毒學感染特征相對應。綜合分析提示，臨床上HCMV IgM陽性的KD兒童更需注意其冠狀動脈損害的發生，而早期檢測KD兒童HCMV IgM水平更有助于對其冠狀動脈損害的預測及預防。IgG陽性率對于冠狀動脈損害在本研究中無影響。收集的數據及自測標本均來自于年齡小于5歲的兒童，且未對KD兒童的冠狀動脈損害發生情況進行隨訪，故不能完全排除HCMV的長期潛伏感染促進KD的發生或KD兒童冠狀動脈損害的發生及其他進展，進而不能排除HCMV的感染對較大年齡兒童KD發生發展的影響。

綜上所述，我們發現HCMV的感染雖然與KD的發生無明顯的相關性，但本研究采用血清抗體檢測，血清抗體易受到激素或免疫抑制劑影響，會導致不出現或延遲出現IgM類抗體。KD的治療方案中包含激素，所以不能排除這方面因素造成的誤差。后續進一步驗證試驗可以采用核酸檢測，其敏感性高，干擾小。HCMV IgM陽性的KD兒童冠狀動脈損害的發生比例遠高于HCMV IgM陰性者，HCMV的急性感染很有可能促進其冠狀動脈損害的發生。故臨床上發現KD合并HCMV急性感染需密切關注其冠狀動脈改變。

表5 KD兒童中HCMV IgG陽性與陰性兒童臨床癥狀及血液相關指標的比較