腦動靜脈畸形直徑與載脂蛋白E啟動子基因多態性相關性研究

殷 成，何宗澤，何 森

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院神經外科，四川 成都 610072)

腦動靜脈畸形(Cerebral arteriovenous malformation，AVM)為一種起病突然且常導致患者致殘致死的嚴重腦血管疾病。目前研究發現AVM的形成可能與胚胎形成、生長發育及各種顱內疾病等多種因素相關[1]，但其準確發病原因尚未被闡明。人類載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)俗稱apoE蛋白，腦中apoE含量在人體中位居第二[2]，已有研究證實APOE參與了多種腦出血相關疾病的病理過程[3]。眾所周知某個基因是否表達及表達量取決于特定的啟動子啟動過程，APOE基因的表達同樣受其啟動子調控，目前認為在APOE啟動子區存在多個位點的多態性，而以-219 G/T、-427 T/C和-491 A/T最為重要[4，5]，上述啟動子區域可在體內通過各種等位形式調控APOE基因的表達量及組織特異性等，因而該區域的多態性可能影響中腦血管疾病的發病與轉歸。因此，本研究擬從啟動子的基因多態性這個全新角度去探索AVM與APOE基因型多態性形之間的關系，以求發現AVM在基因啟動子水平可能存在的發病機理。

1 資料與方法

1.1一般資料四川省人民醫院神經外科2015年5月至2018年1月收治的AVM住院患者137例，納入標準：①經CTA證實的腦AVM；②未出血或首次自發出血的患者：③臨床資料記錄完整。排除標準：①脊髓動靜脈畸形；②首次出血后再出血腦AVM患者；③出血后存活不足3天的病例。記錄患者的年齡，患高血壓和高血脂與否等基礎臨床資料，同時，所有患者均予以相應的對癥支持治療。該研究得到醫學倫理委員會的批準，同時獲得患者本人或家屬(患者意識障礙)的同意。

1.2腦動靜脈畸形描述①AVM大小分級，參閱Spetzler-Martin分級法，將CTA圖像所示病變最大直徑為參考標準，分為≤3 cm和>3 cm兩種情況；②依據畸形血管團的引流靜脈情況分為：僅存在腦表淺靜脈引流和有深部靜脈引流兩種類型；③依據畸形血管團是否鄰近腦功能區(感覺運動、語言和視覺皮層，下丘腦和丘腦，內囊，腦干，小腦腳，小腦深部神經核)分為：鄰近腦功能區和不鄰近腦功能區兩種類型。

1.3APOE啟動子基因型的鑒定該流程中患者資料和實驗人員之間為雙盲狀態。采集患者右側肘部靜脈血后使用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)技術檢測。先將血液中全DNA抽提出(DNA抽提試劑盒，Takara公司，日本)，使用引物上游5’-CAAGGTCACACAGCTGGCAAC-3’； 下游5’-TCCAATCGACGGCTAGCTACC-3’，擴增得到1423bp的PCR產物(命名為TrDNA)。隨后使用引物上游5’-CAGAATGGAGGAGGTGTCCG-3’下游5’-GGAGGTGGGGCATAGAGGTCT-3’擴增上述TrDNA，將得到93bp的產物使用MspI內切酶(Takara公司，日本)酶切并凝膠電泳分離，-219 G/T分型為：74bp為G等位基因，93bp的為T等位基因。進一步使用引物上游5'-TGTTGGCCAGGCTGGTTTTAA-3’，下游5'-CTTCCTTTCCTGACCCTGTCC-3’擴增TrDNA，將228bp的產物使用AIu I內切酶(Takara公司，日本)和Dra I內切酶(Takara公司，日本)酶切并電泳分離。-427 T/C分型：144bp和84bp為T等位基因，228bp為C等位基因；-49lA/T型：228bp為T等位基因，200bp和28bp的為A等位基因。

1.4統計學方法統計數據分析采用SPSS 13.0軟件。計數資料以百分數表示，比較采用卡方檢驗。危險因素分析采用Logistic多元回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1APOE啟動子基因型分布本組137例AVM患者的基因型中，APOE啟動子區多態性-219 G/T、-427 T/C、-491 A/T及等位基因頻率見表1，其分布均符合遺傳學Hardy-Weinberg規律(P> 0.05)，即該研究樣本為遺傳平衡群體。

表1 APOE啟動子基因型分布

2.2APOE啟動子多態性與AVM直徑本研究納入腦AVM患者137例，其中86例患者AVM直徑≤3 cm，51例患者AVM直徑>3 cm，檢測所有患者的APOE基因啟動子的多態性。結果提示：①攜帶有啟動子-219 G/T或-427 T/C的患者，其AVM直徑>3 cm的發生率無明顯不同(P> 0.05)；②130例攜帶有-491 A的患者中，其AVM直徑>3 cm比例為37.12%，其遠高于27例攜帶有-491 T的患者中5例的AVM直徑>3 cm比例18.52%(P= 0.011)。見表2。

2.3AVM患者相關臨床資料和AVM直徑在本次納入的全部AVM患者中，平均年齡為31.3歲，男73例，女64例，其中有51例患者AVM直徑>3 cm，而86例患者AVM直徑≤3 cm。結果發現在上述AVM直徑≥73 cm和直徑≤3 cm組中，其指標涉及年齡、性別、血壓、血脂、病變是否臨近腦功能區以及是否深靜脈引流，構成上差異無統計學意義(P> 0.05)，見表3。

2.4臨床因素和APOE啟動子亞型單與AVM直徑的Logistic回歸分析在進行單因素Logistic回歸分析時，深靜脈引流與AVM直徑存在相關性，-491 A也與AVM直徑>3 cm存在相關性，是AVM直徑>3 cm的危險因素，而其余啟動子亞型與AVM直徑>3 cm未表現出相關性。多因素Logistic回歸分析仍然發現-491 A是AVM直徑大于3 cm的危險因素(P= 0.012，OR=1.876，95%CI 0.423～1.709)。

表2 APOE啟動子多態性和AVM直徑的關系 [n(%)]

表3 137例患者臨床資料與AVM直徑

表4 各因素與AVM的Logistic回歸分析

3 討論

本研究納入137例診斷為AVM的患者，其中有51例患者AVM直徑>3 cm，統計分析提示攜帶有-491 A的患者AVM直徑>3 cm比例顯著高于攜帶有-491 T的患者，且單因素和多因素的Logistic回歸分析發現-491 A是AVM直徑>3 cm的危險因素。

腦動靜脈畸形是位于腦實質中的動靜脈畸形，其畸形血管團位于與有重要功能的腦組織區域相臨概率高，因為大體積病變會對腦組織造成壓迫效應，此外因AVM盜血導致其原供血區腦組織的慢性缺血，若畸形血管團破裂出血則對周圍腦組織造成毀滅性后果[6]。目前針對AVM的治療手段包括開顱手術切除、血管內介入栓塞和伽瑪刀照射治療等[7，8]，而血管畸形病變本身的大小仍是用來確定治療手段的重要參考指標，因此本研究將AVM分為>3 cm和≤3 cm兩個組別來進行研究。

既往研究發現很大比例的腦AVM是散發的，然而，隨后的證據支持家庭遺傳因素影響了腦AVM的表型，并支持基因的多態性與該疾病相關[9]。蛋白質表達和功能也許被生物體內普遍存在的基因多態性精確調控，并最終導致人類具體疾病相關外在表型的改變[10]。例如：有研究發現ALK-1包含的內含子多態性在腦AVM中存在較高的頻率[11]。其它基因或單核苷酸多態性也影響顱內出血[12]、診斷后的顱內再出血[13]、以及顱內出血后的治療效果[14]等腦AVM的主要臨床過程。上述研究結果證實了腦AVM與基因多態性存在明顯的聯系，但與人類中樞神經系統關系極為密切的apoE蛋白尚未得到足夠關注。人類apoE蛋白在腦中的總含量位居各個器官中第二位[2]。人體中APOE存在三個等位基因ε2，ε3，ε4，與之相對應則有三個apoE蛋白亞型apoE 2，apoE 3，和apoE 4，三者相互之間僅有一個氨基酸位點不同[15]，卻存在截然不同的生物學效應。已有研究證明apoE的不同亞型與腦AVM的臨床表現存在聯系。Pawlikowska等發現APOEε2攜帶者的動靜脈破裂出血率為非攜帶者的5倍[13]。Achrol等的研究納入了經歷了手術、介入或栓塞治療后AVM的患者，結果發現攜帶APOEε2的患者其治療后再出血的風險是非攜帶者的3.2倍，而且該風險僅存在于非手術治療組[14]，上述研究提示腦AVM出血與APOE基因多態性存在明顯關聯，但腦AVM的其他特性與APOE的關系尚未被報道，同時能調控APOE基因轉錄和蛋白表達的APOE基因啟動子[16]在腦AVM中扮演的角色則從未曾揭示。而在本研究中，則開拓性地探究了APOE基因啟動子多態性和腦AVM之間的關系。

ApoE為載脂蛋白，通過與其受體結合而在細胞及組織間轉運脂質為其基本功能，而人體動靜脈血管作為運送血液的機械管道則主要由內皮細胞、纖維蛋白等組成，二者之間表面上似乎不存在聯系，但本研究卻發現腦AVM和患者攜帶有APOE啟動子-491 A相關，該結果可能有如下兩點潛在意義。首先，腦AVM的發生有可能與顱內的脂質代謝相關。在成年人群中，脂質和血管相關性疾病已被廣泛關注，尤其是導致多個臟器病變的動脈粥樣硬化；而在胚胎時期，也有研究提示脂質與顱內血管發育相關，Harland等報道在小雞胚胎發育過程中，作為脂質的前列腺素影響了大血管直徑[17]，因此推測apoE與腦AVM形成過程存在關聯。其次，載脂蛋白apoE在腦AVM的發生過程中，很可能不僅僅扮演了其搬運脂質的作用，而更可能參與了腦AVM發生過程中的分子信號通路調節。基于腦AVM可能為先天發育異常，而個體基因在受精卵時期已定型，因此APOE啟動子有可能在胚胎發育期間即開始扮演其負面角色，通過影響apoE進而干預信號通路調節。

綜上所述，本研究盡管首次揭示了在分子層面的APOE啟動子與腦AVM大小的關系，但APOE啟動子如何在AVM的病理生理過程中發揮作用以及其可能的分子調控機制仍有待于闡明，以期繼而能助于腦AVM的預防和治療。