肝組織病毒學檢測對血清HCV RNA陰性慢性HCV感染者診治價值探討

寇 艷，紀風兵，范 凌，羅鳳蓮

(成都醫學院第一附屬醫院感染科，四川 成都 610500)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的病毒性感染，主要經針刺、吸毒、血液系統傳播[1]。統計顯示，世界范圍內HCV感染率約為3%，每年新發丙型肝炎病例逾3萬人次，可引起肝臟慢性組織炎癥及肝纖維化，嚴重者可能進展為肝硬化及肝細胞肝癌，威脅患者生命安全[2]。目前用于HCV感染的常規檢測方法包括抗-HCV及血清HCV RNA定量檢測，其中抗HCV產生是HCV感染的重要標志，但研究發現，抗-HCV檢測特異性較低，受機體免疫狀態影響較大[3]。而血清HCV RNA定量則可直接測定患者外周HCV RNA水平，有較高的特異性，可確診HCV感染，監測HCV病毒復制及抗病毒免疫應答狀況。但受到機體免疫差異、血清HCV RNA水平低、肝硬化HCV復制空間有限等因素的影響，部分HCV感染患者無法檢出血清HCV RNA陽性，一般將此類患者成為隱匿性HCV感染。對部分血清學HCV RNA陰性但易出現外周血細胞減少癥、脾腫大及肝臟形態學改變的患者，若未及時確診，導致治療延誤，則可引起病情不可逆進展，嚴重影響患者預后[4]。本研究對血清學HCV RNA常規檢查無法明確慢性HCV感染的肝病患者展開經皮穿刺肝組織活檢，進行肝組織HCV RNA定量及基因型檢查，旨在明確血清學HCV RNA陰性慢性HCV感染患者肝組織HCV RNA陽性情況，并指導抗病毒治療，以評價肝組織病毒學檢測對血清HCV RNA陰性慢性HCV感染患者的臨床診療價值。

1 資料與方法

1.1一般資料2012年2月至2015年5月我院收治的46例血清HCV RNA陰性慢性HCV感染患者。納入標準：抗-HCV陽性，伴或不伴肝功能影像學異常、肝功能異常，或抗-HCV陰性，但伴反復肝功能異?；蚋闻K影像學異常；連續測定3次血清HCV RNA陰性；無經皮穿肝組織活檢禁忌證；獲得患者及家屬知情同意。排除標準：無法配合經皮肝穿活檢者；既往有不明原因出血史或有出血傾向者；合并肝血管瘤或其他血管性腫瘤者；無法確定合適穿刺點者；合并肝包蟲病者；合并凝血功能障礙者；入組10天內應用非甾體類抗炎藥物者；合并大量腹水者；腹腔、胸腔嚴重感染者；合并自身免疫功能缺陷者；有癥狀性心臟病者；既往接受抗病毒治療者；合并乙型肝炎病毒(HBV)感染、代謝性肝病、藥物性肝病等；失代償期肝硬化者；合并精神疾病者；妊娠或哺乳期女性。其中男20例，女26例；年齡22～75歲[(46.6±5.7)歲]；體重指數(BMI)(25.5±4.5)kg/m2；谷丙轉氨酶(ALT)(139.5±59.5)IU/L，甘油三酯(TG)(2.8±1.8)mmol/L；血糖(6.8±3.3)mmol/L。

1.2方法①肝組織HCV RNA測定。所有患者入院后均行凝血常規、血常規及肝臟影像學檢查，確定無經皮穿刺肝組織活檢禁忌證。在彩色多普勒超聲指導下定位穿刺點，確定穿刺深度，常規消毒穿刺點周圍皮膚，無菌鋪巾，1%利多卡因局部浸潤麻醉，麻醉起效后采用18 G半自動活檢肝穿刺針行快速經皮穿刺肝組織活檢，均取材2次，肝組織標本長度超過15 mm，福爾馬林溶液固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續切片，經行HE、Masson及嗜銀網狀纖維染色，光鏡下觀察，進行肝組織病理炎癥壞死評分(Knodell HAI評分系統)及肝纖維評分(Ishak評分)。并留取外周血標本，血清HCV RNA、肝組織HCV RNA定量采用熒光定量聚合酶聯反應法(PCR)，采用羅氏公司LightCycler 480Ⅱ實時熒光定量PCR系統進行測定，試劑盒購自深圳凱杰生物工程有限公司。②血清抗-HCV測定。均留取外周血標本，采用酶聯免疫法測定抗-HCV，試劑盒購自中山生物工程有限公司，采用SEAC公司Alisei全自動酶免分析系統測定，樣品光密度值(OD值)≥臨界值(cut-off值)視為抗-HCV陽性，比較抗-HCV陽性或陰性患者肝組織HCV RNA陽性情況。③HCV基因分型測定。采用測序法測定HCV基因分型，提取HCV RNA，試劑盒購自Qiagen公司，行HCV Core/E1熒光定量PCR擴增，引物由上海英駿生物技術有限公司設計及合成，采用MJ Reasearch公司PTC-420型全自動PCR擴增儀，核酸測序以熒光定量PCR擴增產物為模板，測序引物同擴增引物，HCV基因分型采用MEGA5序列分析軟件及NCBI在線基因分型工具。④抗病毒治療。對基因1型患者采用聚乙二醇干擾素α-2a(瑞士 Roche Pharma (Schweiz) Ltd，國藥準字S20120047)聯合利巴韋林(中國藥科大學制藥有限公司生產，國藥準字H10970280)治療，聚乙二醇干擾素α-2a，皮下注射，180 μg，1次/周；利巴韋林，1000 mg/d，分2次口服，肝組織Ishak纖維化評分≤4分者，療程為12個月，并隨訪6個月；肝組織纖維化評分>4分者療程為18個月，隨訪6個月。非基因1型者皮下注射聚乙二醇干擾素α-2a，180 μg，1次/周；利巴韋林，800 mg/d，分2次口服，療程6個月，隨訪6個月。治療過程嚴密監測血常規，酌情調整藥物劑量或停藥。

1.3評價標準①肝組織病理炎癥壞死評分。參照Knodell HAI評分系統[5]，內容包括匯管周圍壞死(10分)、肝小葉內變性和灶狀壞死(4分)、匯管區炎癥(4分)，總分18分，評分越高，表示肝組織病理炎癥壞死程度越高。②肝纖維評分。參照Ishak評分[6]，共0～6分，表示無纖維化、某些區域纖維化、大部分匯管區纖維化擴展、大部分匯管區橋樣纖維擴展、明顯纖維化擴展、明顯橋樣纖維化伴小結節、可能或肯定存在纖維化。分別于抗病毒治療前、末次隨訪進行上述評分，評估抗病毒治療效果，并統計患者肝組織病毒學陰轉率。

1.4統計學方法采用SPSS 19.0軟件處理數據。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，計量資料比較采用t檢驗，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1抗-HCV陽性或陰性患者肝組織HCVRNA陽性率比較 46例患者肝組織HCV RNA陽性33例，陽性率71.74%；抗-HCV陽性41例(89.13%)，陰性5例(10.87%)。抗-HCV陽性患者肝組織HCV RNA陽性率為75.61%，抗-HCV陰性患者肝組織HCV RNA陽性率為40.00%，差異無統計學意義(χ2=2.787，P> 0.05)，見表1。

表1 抗-HCV陽性或陰性患者肝組織HCV RNA陽性率比較[n(%)]

2.2肝組織HCVRNA陽性患者HCV基因型分布33例肝組織HCV RNA陽性患者中HCV基因型為1型者18例，(54.55%)，非1型15例(45.45%)，其中包括基因2型9例(27.27%)，基因3型6例(18.18%)。

2.3肝組織KnodellHAI評分、Ishak評分比較抗病毒治療前，患者肝組織Knodell HAI評分、Ishak評分處于較高水平，末次隨訪，患者肝組織Knodell HAI評分、Ishak評分均降低，與治療前比較差異有統計學意義(P< 0.05)，見表2。

表2 抗病毒治療前后患者肝組織Knodell HAI評分、Ishak評分比較(分)

2.4不同HCV基因型患者肝組織HCVRNA陰轉率比較非1型慢性HCV感染患者末次隨訪肝組織HCV RNA陰轉率高于1型慢性HCV感染患者(χ2=4.332，P< 0.05)，見表3。

表3 不同HCV基因型患者肝組織HCV RNA陰轉率比較[n(%)]

3 討論

丙型肝炎為HCV感染所致傳染病類型，以血液傳播為主要途徑，早期癥狀不典型，起病隱匿，易漏診，延誤治療，影響患者預后[7]。早期確診HCV感染，則可為丙型肝炎傳播控制奠定基礎。目前用于丙型肝炎HCV感染檢測的方式包括HCV抗體檢測、HCV RNA測定及HCV基因型測定[8]，其中抗HCV抗體檢測是最早用于HCV感染診斷的方式，其操作簡單，耗時短，但假陽性率高，特異性低[9]。Bradshaw等[10]報道發現，抗-HCV陰性丙型肝炎患者可在肝組織檢出HCV RNA復制，而血清學HCV RNA雖特異性較高，但受到免疫因素、肝硬化病情、血清內HCV RNA低水平等影響，部分HCV感染患者血清核心抗原大部分被病毒包膜蛋白覆蓋，導致血清內HCV RNA含量極低，且HCV屬單鏈RNA病毒，基因突變率高，變異性強，導致HCV核心抗原無法特異性擴增靶物質，無法放大檢測信號，引起漏診[11，12]。且HCV急性感染伴免疫缺陷患者，HCV感染后抗體出現時間晚，濃度低，無法篩出HCV RNA。朱慶峰等[13]報道，部分原因未明持續性肝功能異常慢性肝病患者血清HCV RNA陰性者肝組織存在HCV RNA病毒復制。HCV屬黃病毒科，為嗜肝型病毒，HCV感染后HCV先經肝細胞膜釋放，隨后進入血液系統，并在外周血中檢出HCV RNA[14]，因此認為，肝組織HCV RNA病毒學變化可能先于血清學改變[15，16]。

本研究結果發現，46例患者HCV RNA陰性患者肝組織HCV RNA陽性33例，陽性率為71.74%，表明血清HCV RNA檢測無法完全替代肝組織病理活檢。同時對抗-HCV陽性及陰性患者肝組織HCV RNA進行檢測發現，抗-HCV陰性患者仍有一定比例的肝組織HCV RNA陽性率，與常靜霞等[17]報道結論相似，提示常規抗-HCV檢測對HCV感染存在一定的局限性，即便抗-HCV陰性的患者亦無法完全排除HCV感染，因此對有明顯肝功能損傷但抗-HCV陰性者需進一步行經皮穿刺肝組織活檢，盡早確診丙型感染，為患者臨床治療提供指導。同時本研究對所有肝組織病毒學確診為HCV RNA陽性患者進行抗病毒治療，并根據患者不同基因分型采用不用劑量藥物干預，結果顯示，末次隨訪所有患者肝組織病理炎癥壞死評分、肝纖維化評分均顯著降低，且非1型HCV感染患者末次隨訪病毒學陰轉率較高，達80.00%，與王江南等[18]報道的76.7%相似，肯定了肝組織病理學檢測對慢性HCV感染抗病毒治療的指導價值。

綜上所述，對血清HCV RNA陰性、抗-HCV陰性且原因不明反復肝功能異?；颊?，建議行經皮穿刺肝組織活檢，對肝組織炎癥壞死程度及纖維化程度進行評估，并行肝組織HCV RNA定量測定，對肝組織HCV RNA陽性者予抗病毒治療，可延緩患者病情進展，提高HCV RNA陰轉率，有助于改善患者預后。