上皮性卵巢癌中MRP1、BCRP、BRCA1基因的表達及其意義

楊 軍，彭 梅

(1.四川省涼山彝族自治州第二人民醫院檢驗科，四川 西昌 615000；2.四川大學華西廣安醫院檢驗科，四川 廣安 638000)

卵巢癌是女性常見的三大惡性腫瘤之一，由于臨床癥狀不明顯，發病較為隱匿，大部分患者來院就診時已屬晚期[1]。臨床資料表明，上皮性卵巢癌的發病率約占卵巢癌總發病數的90%[2]。目前臨床對于上皮性卵巢癌的治療多采用手術聯合化療的方案，但近年來發現，約有25%的卵巢癌患者對化療藥物存在原發耐藥，60%以上的患者存在繼發性耐藥[3]。盡管近年來卵巢癌患者通過化療5年生存率已有所提高，但由于化療耐藥的存在導致5年生存率只有20%[4]。因此，對上皮性卵巢癌化療耐藥的機制進行探討，為上皮性卵巢癌的化療用藥提供指導是當前研究較為熱門的課題。研究表明，多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、乳腺癌易患基因1(breast cancer 1，early onset，BRCA1)可能與上皮性卵巢癌的化療耐藥及預后相關[5～7]，本研究對MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌中的表達及其意義進行研究。

1 資料與方法

1.1一般資料2013年3月至2016年5月在我院實施手術治療的47例上皮性卵巢癌患者。納入標準[8]:①經病理檢查確診為上皮性卵巢癌；②術前未進行過化療，術后實施以順鉑為基礎的化療6個療程。年齡25～68歲[(49.3±4.2)歲]。根據耐藥情況分為兩組，其中耐藥組22例，年齡25～67歲[(48.7±3.5)歲]；敏感組25例，年齡26～68歲[(49.1±3.2)歲]。另選20例正常卵巢組織標本作為對照組，標本來自子宮肌瘤實施子宮和附件切除手術并經病理檢查確定卵巢組織正常者，年齡25～66歲[(48.8±3.1)歲]。三組研究對象的基礎資料比較，差異無統計學意義(P> 0.05)，具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有受試者均知情同意并自愿簽署同意書。

1.2材料與試劑Trizol試劑(美國Invitrogen公司，批號:15596026)、氯仿(北京化學試劑廠，批號:1041191)，異丙醇(北京化學試劑廠，批號:GF0516)、乙醇(北京化學試劑廠，批號:GF0498)反轉錄試劑盒(美國Promega公司，批號:A3500)、實時熒光定量PCR反轉錄試劑盒(美國Promega公司，批號:A5003)、實時熒光定量PCR引物(美國Invitrogen公司，批號:F02001)、0.1%二乙基焦磷酰胺水(實驗室自制)。

1.3方法采用實時熒光定量PCR技術對上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織中MRP1、BCRP、BRCA1基因的表達情況進行檢測:①無菌條件下用剪刀獲取組織并置于液氮盒內，凍存于-80 ℃冰箱；②經研磨勻漿、分層、RNA洗滌、沉淀及RNA溶解保存提取組織總RNA；③采用核酸定量對組織總RNA的濃度和純度進行測定；④RNA反轉錄為cDNA、目的基因擴增，分兩步完成對MRP1、BCRP、BRCA1基因的測定。

1.4化療耐藥的判定化療療效通過盆腔和腹部檢查、糖類抗原125水平，并結合超聲、CT或二次探查術所見評價。當初次化療后未出現臨床證實的緩解(即臨床癥狀仍存在，盆腔或超聲檢查仍有包塊，血清糖類抗原125未下降至正常水平)或在化療后6個月內出現復發即可判定為耐藥。

1.5統計學方法應用SPSS 17.0軟件對數據進行處理，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本的t檢驗，計數資料的比較采用χ2檢驗，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MRP1、BCRP、BRCA1表達的比較MRP1和BCRP在上皮性卵巢癌組織中的表達量與表達率均高于正常卵巢組織(P< 0.05)。BRCA1在上皮性卵巢癌組織中的表達量和表達率與正常卵巢組織比較差異無統計學意義(P> 0.05)。見表1、2，圖1。

2.2MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐藥組與敏感組中的表達情況耐藥組MRP1、BCRP及BRCA1的表達量和表達率均高于敏感組(P< 0.05)。見表3、4，圖2。

表1 上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中MRP1、BCRP、BRCA1相對表達量比較

圖1 兩組MRP1、BCRP、BRCA1 mRNA電泳結果(1～3為上皮性卵巢癌組織；4～6為正常卵巢組織)

表2 上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中MRP1、BCRP、BRCA1表達率比較 [n(%)]

表3 MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐藥組與敏感組的相對表達量

表4 MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐藥組與敏感組的表達率比較 [n(%)]

圖2 兩組MRP1、BCRP、BRCA1 mRNA電泳結果(1～3為耐藥組；4～6為敏感組)

3 討論

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，也是預后最差的惡性腫瘤之一。盡管臨床上通常采用手術治療，但術后化療仍然是治療的重要手段。卵巢癌患者的預后情況直接取決于其對化療的反應，近年來隨著各類化療藥物和技術的應用，卵巢癌患者初始化療反應率可達80%，但由于耐藥的存在，卵巢癌患者的5年生存率仍然較低，只有30%[9，10]。化療耐藥目前已成為影響卵巢癌患者預后的重要因素[11]，研究發現[12]，20%～30%的上皮性卵巢癌患者為原發鉑類耐藥，80%的患者在治療過程中出現耐藥。腫瘤細胞對化療耐藥是多方面的，包括:①增強DNA損傷的耐受性與損傷后的自我修復[13]；②增強藥物的外排，減少藥物在細胞內的積聚；③促進藥物失活。耐藥基因的異常表達是腫瘤耐藥的一個重要方面，基于此，近年來很多醫院將卵巢癌耐藥基因的表達作為監測、評估患者預后的重要指標[14]。MRP1、BCRP和BRCA1是臨床已經證實的與化療耐藥相關的基因[15～17]，而關于其在上皮性卵巢癌組織中的表達及其與耐藥的關系尚未見相關報道，本研究就此進行探討。

MRP1蛋白是一種多藥耐藥相關蛋白，與藥物轉運有關，屬于ATP-結合盒超家族成員，其主要功能是將細胞內帶負電荷的分子排出胞外。化療藥物在細胞內被代謝成帶負電荷的離子，從而被MRP1蛋白轉移至胞外，進而無法發揮作用。這是MRP1介導的化療耐藥的主要作用途徑。MRP1蛋白的高表達可導致非P-糖蛋白介導的多藥耐藥。本研究表明，MRP1在上皮性卵巢癌組織中的表達量和表達率均較正常卵巢組織升高，這與黃好亮等[18]和陳亮等[19]的研究結果一致。本研究還發現，耐藥組患者MRP1的表達量和表達率均顯著高于敏感組，其機制可能是順鉑類化療藥物能夠誘導上皮性卵巢癌組織過量表達MRP1，而過量MRP1能提高轉運負電荷藥物能力，降低細胞內藥物濃度，進而降低臨床療效，可能提高患者耐藥性。

BCRP屬于ATP-結合盒膜轉運蛋白超家族成員。BCRP可介導上皮性卵巢癌的耐藥，但相對于金屬蛋白酶、P-糖蛋白等ATP-結合盒膜轉運蛋白超家族的其他成員，BCRP介導的是非典型耐藥，隨著BCRP表達的增高，BCRP細胞對甲氨蝶呤、吡柔比星、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷等抗癌藥的耐藥指數增加，但其在人體正常的作用尚不明確[20]。本研究顯示，BCRP在上皮性卵巢癌組織中的表達量、表達率均低于正常卵巢組織，其中耐藥組中的表達率也低于敏感組，這可能是由于BCRP在化療生存中有一定的保護作用，而目前卵巢癌組織中的BCRP的研究甚少，BCRA是否能預測化療藥物耐藥敏感仍是熱點問題。

本研究顯示，BRCA1在上皮性卵巢癌組織中的表達量和表達率與正常卵巢組織相比差異均無統計學意義。與吳氫凱等[21]的研究結果一致。此外，耐藥組患者BRCA1的表達量和表達率均明顯高于敏感組，說明BRCA1的高表達會抑制化療藥物功能的發揮，其原因可能是因為BRCA1能夠增強細胞的修復能力，從而使細胞產生耐藥性而不易被化療藥物殺死。

綜上所述，MRP1，BCRP在上皮性卵巢癌組織中的表達量會顯著增加，BRCA1表達量變化不顯著。三種基因表達量增加均與化療耐藥的產生有關。