肝再生增強因子與大鼠肝移植急性排斥反應的相關性分析

龍飛伍，李世紅，劉 展，李云濤，劉雁軍，侯 康，張 抒

(成都市第三人民醫院普通外科，四川 成都 610031)

肝臟移植作為終末期肝病的唯一治療手段，近年來發展迅速，然而免疫抑制劑價格昂貴且長期服用免疫抑制劑可能帶來的各種毒副作用嚴重影響肝移植的發展，同時已經實施肝移植手術的患者術后慢性排斥反應也逐年增加。所以，在研究中揭示肝移植免疫及急性排斥反應機制及其調控方法，研究高效能、無毒性的免疫抑制劑是目前國內外研究的熱點。肝再生增強因子(augmenter of liver regeneration，ALR)是從初生大鼠肝組織提取出來的蛋白質，能夠特異性促進肝切除后肝組織再生及肝細胞增殖[1]，在急性及慢性肝炎、肝硬化患者肝組織中均能夠檢測到ALR表達增加[2]。外源性給予重組人ALR(Recombination human augmenter of liver regeneration，rhALR)能夠保護大鼠實驗性肝纖維化、肝硬化及藥物性肝損傷[3～5]。最近的研究發現肝臟自然殺傷細胞(Nature kill cell，NK cell)的活性被ALR所抑制，減少產生及分泌INF-γ，顯現出ALR調控免疫活性的特性[2，6，7]。最新的體外實驗發現外周血單核細胞活化及增殖也被ALR的活性所抑制，繼而減少IL-2合成及分泌，這一結果直接表明ALR免疫調控的能力及作用方式[8，9]。作為內生性的肝臟免疫及營養調節因子，現有的研究結果尚未揭示肝移植免疫調節中是否有ALR參與及其機制，值得我們進一步的探討。

本研究成功建立了同種同基因及同種異基因大鼠肝移植動物模型，觀察肝臟移植后大鼠的肝功能變化和移植物組織中INF-γ、IL-2和ALR的表達，嘗試在體內實驗研究中探討大鼠肝移植后移植物急性排斥反應過程中ALR與INF-γ之間及ALR與IL-2之間表達變化趨勢的相關關系，探討肝移植后移植物急性排斥反應中ALR可能的生物學作用及具體機制。

1 材料與方法

1.1材料本研究自2009年3月至2012年6月，ALR兔抗大鼠單克隆抗體由重慶醫科大學第二附屬醫院病毒性肝炎研究所贈送；總RNA提取試劑盒購自Promega中國公司；逆轉錄試劑盒及SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自大連TaKaRa公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗購自Santa Cruz公司；大鼠IL-2及INF-γ 酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒購自晶美(深圳)生物科技有限公司；RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF購自碧云天(上海)生物技術有限公司；其他相關實驗試劑均定購于相應的試劑公司。

1.2實驗動物及分組采用改良的Kamada[10，11]“二袖套法”進行大鼠原位肝移植。LEW和BN大鼠購自北京維通利華試驗動物技術有限公司。術前禁食12小時，禁水6小時，采用乙醚吸入麻醉，建立急性排斥大鼠肝移植動物模型組(急性排斥組，LEW到BN) 12只及免疫耐受大鼠肝移植動物模型組(免疫耐受組，BN到BN) 12只。術后第1、3、5和7天兩大鼠各組隨機處死3只，取血漿-70 ℃冰箱保存，肝臟組織液氮迅速冷凍后保存于-150 ℃冰箱備用。

1.3肝功能檢測兩組大鼠肝移植后外周血漿中TBIL、ALT及AST采用全自動生化分析儀(BeckmanCX7)自動檢測。

1.4Real-timePCR檢測肝臟移植物組織內ALR、INF-γ及IL-2mRNA的表達按Promega公司SV Total RNA Isolation System提取試劑盒的操作說明完成肝臟移植物總RNA抽提。按逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)操作說明完成逆轉錄反應來合成cDNA鏈。ALR(5’-AGCTGGATATGGCGCACATCA-3’，5’-AATTCAGGCATGCCCACCTTC-3’)；INF-γ (5’-ACGCCATCACCAACAAGATAAGTA-3’，5’-CACAGCT TAGTGCAGGATCTCTG-3’)；IL-2 (5’-AACGCTGGA ATTTTCATCTGCA-3’，5’-GCACATCATCGTATTGGCT CTC-3’) ；β-actin(5’-GCAGATTACAGCCCTGGGTCCTA-3’，5’-GTCTCATCGTAGTCCTGCTAGCTG-3’)，由TaKaRa公司(大連)完成引物設計及合成。按TaKaRa大連公司Realtime PCR試劑盒操作說明(25 μl體系)完成定量PCR反應。所有讀數均以β-actin值進行校正后用2-ΔΔCT值表示[12]。

1.5ELISA檢測肝臟組織內INF-γ和IL-2含量取-150 ℃保存的肝臟組織約500 mg移入玻璃勻漿器，加入預冷PBS(0.02 mol/L，pH 7.0～7.2)3 ml于冰浴下反復研磨，勻漿液移入EP管中于冰浴下超聲破碎進一步處理，5000轉離心5分鐘，留取上清備用。按大鼠INF-γ及IL-2 ELISA檢測試劑盒操作說明完成肝臟組織內INF-γ及IL-2檢測。

1.6Westernblotting檢測肝臟組織內ALR蛋白的表達采用RIPA裂解液及PMSF提取肝臟組織總蛋白。Thermo BCA 蛋白濃度檢測試劑盒，檢測各樣本蛋白濃度，根據最終計算的上樣量加入5×Loading Buffer，100 ℃水浴5 min變性蛋白質，自然冷卻后分裝，-80 ℃保存。按Western blotting操作流程制備12%分離膠，4%濃縮膠，根據計算好的各樣品上樣量上樣，每孔50 μg，(空余的孔加入10 μl 1×Loading Buffer)。選擇恒定電壓下電泳，濃縮膠40 V，分離膠80 V。恒定電流300 mA完成轉膜。TBST配制的5%脫脂牛奶封閉后加入稀釋好的ALR抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次后按1∶5000加入二抗，室溫下孵育1 h。TBST洗滌3次后采用ECL試劑盒顯影，采集圖像。

1.7統計學方法數據均采用SPSS 16.0軟件進行分析。所有相關實驗數據表示為均數±標準差，兩組間比較采用t檢驗，ALR和INF-γ以及ALR和IL-2蛋白表達變化的相關性應用Pearson相關分析完成，并用線性回歸分析得出回歸方程。P< 0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1大鼠肝移植后肝功能變化兩組肝移植術后第1天ALT、AST和TBIL比較，差異無統計學意義(P> 0.05)。急性排斥組術后第3、5、7天ALT、AST和TBIL高于術后第1天，差異有統計學意義，而免疫耐受組上述各項指標在術后不同時間點比較差異無統計學意義；術后第3、5、7天兩組間比較，急性排斥組ALT、AST、TBIL明顯高于免疫耐受組，差異有統計學意義(P< 0.05)。見表1。

表1 肝移植后大鼠肝功能ALT、AST和TB水平變化

*組內與術后第1天比較，P< 0.05；#與免疫耐受組比較，P< 0.05

2.2肝組織內IL-2的表達兩組術后第1天IL-2 mRNA比較，差異無統計學意義(P>0.05)。急性排斥組術后第3、5、7天IL-2 mRNA表達明顯高于術后第1天，且明顯高于免疫耐受組，差異有統計學意義(P< 0.01)。肝臟組織內IL-2表達與IL-2 mRNA一致。

2.3肝組織內ALR的表達術后第1天兩組ALR mRNA比較差異無統計學意義(P>0.05)。第3、5、7天急性排斥組及免疫耐受組ALR表達均高于術后第1天，差異有統計學意義(P< 0.05)。術后第3天兩組ALR mRNA表達均明顯低于術后第1天，且免疫耐受組明顯高于急性排斥組，差異有統計學意義(P< 0.05)。術后第5、7天免疫耐受組 ALR mRNA表達明顯高于急性排斥組，差異有統計學意義(P< 0.05)。術后第5、7天急性排斥組ALR蛋白表達明顯低于免疫耐受組，差異有統計學意義(P< 0.05)，見表2。

表2 移植肝臟組織內INF-γ、IL-2與ALR表達

*與術后第1天比較，P< 0.05；★與術后第3天比較，P< 0.05；#與免疫耐受組比較，P< 0.05

2.4肝組織內INF-γ的表達術后第1天急性排斥組肝臟組織內INF-γ mRNA表達明顯高于免疫耐受組，且急性排斥組術后第3天明顯高于第1、5、7天，差異有統計學意義；免疫耐受組各時間點之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。肝臟組織內INF-γ表達與INF-γ mRNA一致。

2.5ALR表達與急性排斥反應的相關性分析大鼠肝移植術后急性排斥反應發生時同種異基因組ALR與INF-γ 表達呈明顯的負相關(r=-0.6833，P< 0.05，y=-223.99x+545.15，圖1a)，而與IL-2的表達無顯著的相關性 (r=0.3775，P> 0.05，圖1b)。

圖1 ALR與INF-γ和IL-2表達相關曲線

3 討論

根據文獻報道Hagiya等研究者[1]1994年在胎兒大鼠來源的肝臟組織中首次分離出能特異性的促進部分肝切除后肝臟組織及肝細胞再生的生長因子，稱為肝再生增強因子。其實質上是一種能夠催化蛋白質間二硫鍵形成的連接了黃素腺嘌呤核苷酸的巰基氧化酶(FAD-linked sulfdryl oxidase)[13]。

后來的研究在肝臟及睪丸組織發現ALR高表達，同時肝臟和睪丸組織是公認的免疫特惠器官。肝臟或者睪丸與其他器官或組織聯合移植，可以誘導相關目標移植物表現出免疫耐受，目標移植物生存時間得以延長[14～16]。研究發現ALR能夠在實驗中抑制NK細胞活性，減少IFN-γ的表達及分泌[2]。肝臟干細胞移植后ALR能夠抑制其免疫排斥反應，在體外研究中效果優于環孢素A；肝臟干細胞移植聯合ALR治療急性肝衰竭，治療效果比單純干細胞治療得到明顯提高。體外研究結果證實，ConA誘導的脾臟單核細胞增殖及活化被ALR抑制，其合成及分泌IL-2明顯減少；因此有學者認為認為ALR本身具有免疫抑制能力[8，9]。潘桃等[17]的研究發現hALR能夠通過誘導Treg細胞的增殖和分化，促進TGF-1及IL-10的產生，從而調節免疫反應。

我們在研究結果中發現無免疫抑制劑干預的條件下我們觀察到急性排斥組大鼠術后第1天IFN-γ的表達明顯升高，最高峰值在術后第3天出現，在術后第5、7天開始出現逐漸下降的趨勢；免疫耐受組肝移植術后各個時間點的IFN-γ表達均顯著低于急性排斥組，數據在較低水平波動。Liang等[18]的研究結果發現大鼠肝移植后ALR與IFN-γ mRNA表達呈負相關，但ALR在肝臟組織內廣泛表達，其轉錄水平的變化不能準確反映ALR蛋白的功能狀態，因此我們在研究中從蛋白質水平探討了ALR與IFN-γ及IL-2表達的相關性。我們的研究結果與Hideaki[19]的研究結果一致，相關性分析發現同種異基因移植組移植肝臟組織內IFN-γ與ALR蛋白表達呈明顯的負相關，我們推測ALR可能通過參與調節IFN-γ表達而影響急性排斥反應。

Oliveira等[20]研究了腎移植后腎臟組織活檢提取的原代細胞分泌的細胞因子，發現22例患者出現急性排斥反應時血清中IL-2含量明顯升高，而在病情穩定的21例患者血清中僅檢測到少量IL-2表達。我們在研究中發現急性排斥組肝移植術后第3天開始外周血中能夠檢測到IL-2表達增加，而且進行性表現為逐漸增高的趨勢；而免疫耐受組肝移植術后IL-2的表達在不同的時間無顯著差異。相關性分析結果發現ALR與IL-2的表達變化無統計學差異。Chen等[21]在研究中觀察到在大鼠肝移植后立即給予rhALR移植肝臟組織病理改變明顯減輕，移植物組織內IFN-γ與IL-2的表達明顯下降，從而促進T淋巴細胞的凋亡，而Xie[8]等在體外研究中的研究結果與此相同。我們的在研究中發現ALR與IL-2蛋白表達不相關，可能與同種異基因移植組肝移植后急性排斥反應過程未被干預，ALR表達被影響有關；也可能與細胞因子網絡調控影響了急性排斥反應的過程有關。

綜上所述，我們在未給予外源性免疫抑制藥物干預的情況下通過體內實驗研究了肝移植后移植肝臟內ALR與IL-2及ALR與IFN-γ在發生急性排斥反應時的表達變化關系。我們在研究中發現大鼠肝移植后急性免疫排斥反應過程可能受到ALR的調控，而具體機制可能是ALR通過調節免疫細胞合成及分泌細胞因子來實現，Wang等[22]在研究中發現肝臟kupffer細胞表面廣泛分布著ALR受體，kupffer細胞合成及分泌免疫細胞因子受到ALR調控。因此，我們在這里推測ALR能夠抑制肝臟移植物急性免疫排斥反應，其具體機制可能是ALR結合到KCs細胞膜上的受體，調控KCs合成及分泌免疫活性細胞因子，從而調節Th活性，最后實現調控肝細胞增殖及細胞免疫作用。