抗腫瘤藥卡培他濱有關(guān)物質(zhì)分析方法驗(yàn)證

（廣東省輕工業(yè)技師學(xué)院 廣東廣州 510320）

卡培他濱（Capecitabine）是一種可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成5-FU的抗代謝氟嘧啶脫氧核苷氨基甲酸酯類抗腫瘤原料藥物，通過體內(nèi)三步酶鏈反應(yīng)轉(zhuǎn)換為5-FU而作用于腫瘤細(xì)胞，能夠抑制細(xì)胞分裂和干擾RNA和蛋白質(zhì)（protein）合成。具有臨床高效低毒價(jià)格低廉的優(yōu)勢，作為一方便、安全、療效確切的抗癌藥，有可能取代5-FU成為胃癌聯(lián)合化療方案的基本用藥。從2001年美國FDA和2002年歐洲藥品管理局（EMEA）批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌開始，先后獲得英國國家健康與臨床優(yōu)化研究所（NICE）和美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）權(quán)威指南的推薦，在全世界范圍已有多項(xiàng)大樣本研究證明其在胃癌、腸癌以及乳腺癌中具有生存獲益。而在我國，卡培他濱自2001年上市8年來，先后被批準(zhǔn)單藥和聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌、腸癌的輔助治療和轉(zhuǎn)移性腸癌的一線治療，直至去年被批準(zhǔn)用于晚期胃癌的一線治療。[1]

本文在國家標(biāo)準(zhǔn)H31022940的基礎(chǔ)上結(jié)合卡培他濱美國藥典USP32版的有關(guān)物質(zhì)控制要求建立了HPLC-UV法測定卡培他濱中有關(guān)物質(zhì)，并對該方法進(jìn)行方法驗(yàn)證。

一、儀器設(shè)備

1.儀器：A gilent1260高效液相色譜儀（紫外檢測器）、電子天平

2.色譜條件：[2]

（1）色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（4.6mm*250mm，5μm）

（2）流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，0.1%醋酸溶液為流動(dòng)相C，進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長：250nm，流速：1.0ml/min，柱溫：40℃進(jìn)樣量：10μl，稀釋劑：甲醇-乙腈-水（25:3:72）

二、有關(guān)物質(zhì)

卡培他濱成品中可能含有的已知雜質(zhì)，雜質(zhì)A（5′-脫氧-5-氟胞苷）、雜質(zhì)B（5’-脫氧-5-氟脲苷）、雜質(zhì)C（2′，3′-氧-羰基-5′-脫氧-5′-氟-N-（戊氧基羰基胞嘧啶核苷））、雜質(zhì)D（2′，3′-二-氧-乙酰基-5′-脫氧-5-氟-N-（戊氧基羰基）-胞嘧啶核苷）、雜質(zhì)E（2′，3′-二- 氧-乙酰基-5′-脫氧-5-氟胞嘧啶核苷）、雜質(zhì)F（5-氟胞嘧啶）、雜質(zhì)J（5-氟-N-[（戊氧基）羰基]-胞嘧啶）、雜質(zhì)L1（5′-脫氧-5-氟-N-[（2-甲基丁氧基）碳基]-胞嘧啶核苷）、雜質(zhì)L2（5′-脫氧-5-氟-N-[（3-甲基丁氧基）碳基]-胞嘧啶核苷）、雜質(zhì)Q（5’-脫氧-5-氟-N-[（甲氧基）羰基]- 胞嘧啶核苷）。

三、方法驗(yàn)證

1.專屬性

（1）各已知雜質(zhì)及成品的定位分離考察

取稀釋劑作空白溶劑，另分別取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)L1、雜質(zhì) L2、雜質(zhì)H、雜質(zhì)M、雜質(zhì)N、雜質(zhì)K1+K2、雜質(zhì)O、雜質(zhì)Q及卡培他濱適量，加稀釋劑溶解制成約6ug/ml樣品，照本品有關(guān)物質(zhì)檢測方法進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。

2.線性范圍及各已知雜質(zhì)校正因子測定

（1）雜質(zhì)A、B、C、D、E、J、L2、Q低濃度線性

精密稱取雜質(zhì)A15.77 mg、雜質(zhì)B13.76mg、雜質(zhì)C15.78mg、雜質(zhì)D13.94mg、雜質(zhì)E15.85mg、雜質(zhì)J13.65mg、雜質(zhì)L2 14.10mg和雜質(zhì)Q15.36mg分別置于25ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液，精密量取各儲(chǔ)備溶液1ml置同一100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為1%對照溶液。精密量取1%對照溶液3ml、5 ml、10ml、20ml分別置100ml、50ml、25ml、25ml的量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得相對1%對照溶液的3%、10%、40%、80%線性溶液。再精密量取儲(chǔ)備溶液1ml置50ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得200%線性溶液，分別取上述線性溶液與1%對照溶液各10μl進(jìn)樣檢測。[3]

3.精密度考察

（1）重復(fù)性考察

取卡培他濱約15mg，精密稱定，共6份，分別置于25ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取1ml置100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。分別取上述對照溶液和供試品溶液各10μl進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。按加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算已知雜質(zhì)的含量，按自身對照法計(jì)算其他單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量，并計(jì)算相應(yīng)雜質(zhì)偏差。

（2）中間精密度考察

取本品適量，按重復(fù)性項(xiàng)下的方法，在同一實(shí)驗(yàn)室，由不同操作者，于不同日期，使用不同儀器進(jìn)行檢測，并與重復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行比較。[4]

4.各已知雜質(zhì)的回收率

雜質(zhì)A、B、C、D、E、J、L1+L2和Q的回收率：

分別精密量取加雜質(zhì)的供試品溶液、不加雜質(zhì)的供試品溶液和對照品溶液10μl進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，按外標(biāo)法分別計(jì)算雜質(zhì)A、C、D、 E、J、L1+L2和Q的回收率。

5.溶液穩(wěn)定性

精密稱取卡培他濱約15mg，置25ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，取該溶液于室溫下放置0、2、4、8小時(shí)后進(jìn)樣檢測，同時(shí)將該供試品溶液在冰箱（2～8℃）中放置，于0、3、12、24小時(shí)后進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，按自身對照法分別計(jì)算各已知雜質(zhì)、其他單個(gè)雜質(zhì)以及總雜質(zhì)大小。[5]

6.耐用性考察

分別使用正常色譜條件（Inertsil ODS-SP C18柱，250*4.6mm，5μm；）、 不 同 色 譜 柱（Agilent，ZORBAX，XDB-C18柱，250*4.6，5μm；Welchrom C18，250*4.6，5μm）；不同柱溫（柱溫為35℃和45℃）；不同流速（流速為0.95ml/min和1.05ml/min）；不同初始流動(dòng)相比例（甲醇-乙腈-0.1%醋酸=23:3:74、甲醇-乙腈-0.1%醋酸=27:3:70）進(jìn)行測試，以面積歸一化法分別計(jì)算供試品溶液雜質(zhì)個(gè)數(shù)和雜質(zhì)大小，主峰理論板數(shù)，主峰與相鄰雜質(zhì)的分離情況，以及各雜質(zhì)的相對保留時(shí)間。

四、驗(yàn)證結(jié)果

項(xiàng)目驗(yàn)證結(jié)果專屬性（1）空白溶劑不干擾樣品及雜質(zhì)的測試；（2）原材料、中間體、各已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)均能與主峰良好分離（3）降解后主峰含量在81.3%～98.9%之間，與降解后主峰HPLC純度差異小于5.0%，物料平衡，且降解后雜質(zhì)與主峰能良好分離、降解樣品中主峰的峰純度均大于999；空白溶劑不干擾主峰及降解雜質(zhì)的測定；線性范圍、各已知雜質(zhì)校正因子測定雜質(zhì)A：在0.1892～12.62μg/ml 濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為1 ；校正因子為0.98雜質(zhì)B：在0.1651～11.01μg/ml 濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為1 ；校正因子為1.26雜質(zhì)C：在0.1894～12.62μg/ml濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9993；校正因子為1.06雜質(zhì)D：在0.1639～10.93μg/ml濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為1；校正因子為1.15雜質(zhì)E：在0.1885～12.566μg/ml濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為1；校正因子為1.10雜質(zhì)J：在0.1609～10.72μg/ml濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為1；校正因子為1.09雜質(zhì)L1：在0.1686～8.432μg/ml濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9995；校正因子為1.03雜質(zhì)L2：在0.1658～11.05μg/ml濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為1；校正因子為1.06雜質(zhì)Q：在0.1812～12.081μg/ml濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9995；校正因子為1.32卡培他濱：在0.1900～12.67μg/ml濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9995檢測限以各雜質(zhì)在樣品中的含量表示：雜質(zhì)A：檢測限為0.001%； 雜質(zhì)B：檢測限為0.001%；雜質(zhì)C：檢測限為0.002%； 雜質(zhì)D：檢測限為0.002%；雜質(zhì)E：檢測限為0.001%； 雜質(zhì)H：檢測限為0.001%雜質(zhì)J：檢測限為0.001%；雜質(zhì)K1：檢測限為0.001%；雜質(zhì)K2：檢測限為0.001%；雜質(zhì)L 1：檢測限為0.002%；雜質(zhì)L2：檢測限為0.001%； 雜質(zhì)M：檢測限為0.001%；雜質(zhì)N：檢測限為0.001% 雜質(zhì)O：檢測限為0.001%；雜質(zhì)Q：檢測限為0.001%；以各雜質(zhì)在樣品中的含量表示：雜質(zhì)A：定量限為0.002%；6針樣品峰面積RSD為0.99%；雜質(zhì)B：定量限為0.004%；6針樣品峰面積RSD為0.88%；雜質(zhì)C：定量限為0.007%；6針樣品峰面積RSD為1.22%；雜質(zhì)D：定量限為0.006%；6針樣品峰面積RSD為1.42%；雜質(zhì)E：定量限為0.003%；6針樣品峰面積RSD為0.88%；雜質(zhì)H：定量限為0.002%；6針樣品峰面積RSD為0.40%；雜質(zhì)J：定量限為0.004%；6針樣品峰面積RSD為1.05%；雜質(zhì)K1：定量限為0.003%；6針樣品峰面積RSD為0.76%；雜質(zhì)K2：定量限為0.003%；6針樣品峰面積RSD為1.92%；雜質(zhì)L1：定量限為0.006%；6針樣品峰面積RSD為0.39%；雜質(zhì)L2：定量限為0.005%；6針樣品峰面積RSD為1.95%；雜質(zhì)M：定量限為0.003%；6針樣品峰面積RSD為1.07%；雜質(zhì)N：定量限為0.003%；6針樣品峰面積RSD為1.59%；雜質(zhì)O：定量限為0.002%；6針樣品峰面積RSD為1.15%；雜質(zhì)Q：定量限為0.004%；6針樣品峰面積RSD為1.54%；卡培他濱：定量限為0.003%；6針樣品峰面積RSD為1.25%。檢出限加入 該方法能檢出殘存的雜質(zhì)K1和K2、雜質(zhì)E、雜質(zhì)H、雜質(zhì)J、雜質(zhì)M、雜質(zhì)N和雜質(zhì)O定量限重復(fù)性：6份樣品任一單個(gè)雜質(zhì)RSD及總雜質(zhì)RSD分別為：雜質(zhì)A：5.51%；雜質(zhì)B：6.81%；雜質(zhì)C：0；雜質(zhì)L1+L2：0%；雜質(zhì)D：未檢出；雜質(zhì)E：未檢出；雜質(zhì)J：未檢出；雜質(zhì)H：未檢出；雜質(zhì)K1+K2：未檢出；雜質(zhì)Q：未檢出；雜質(zhì)M：未檢出；雜質(zhì)N：未檢出；雜質(zhì)O：未檢出；總雜質(zhì)：2.50%。精密度中間精密度：6份樣品任一單個(gè)雜質(zhì)RSD及總雜質(zhì)RSD分別為：雜質(zhì)A：10.29%；雜質(zhì)B：0；雜質(zhì)C：0；雜質(zhì)L1+L2：5.84%；雜質(zhì)D：未檢出；雜質(zhì)E：未檢出；雜質(zhì)J：未檢出；雜質(zhì)H：未檢出；雜質(zhì)K1+K2：未檢出；雜質(zhì)Q：未檢出；雜質(zhì)M：未檢出；雜質(zhì)N：未檢出；雜質(zhì)O：未檢出；總雜質(zhì)：5.35%。精密度項(xiàng)下的12份樣品：任一單個(gè)雜質(zhì)RSD及總雜質(zhì)RSD分別為：雜質(zhì)A：7.63%；雜質(zhì)B：10.29%；雜質(zhì)C：0；雜質(zhì)L1+L2：4.12%；總雜質(zhì)：4.27%

溶液穩(wěn)定性室溫條件：樣品溶液在4小時(shí)內(nèi)雜質(zhì)A變化的絕對偏差為0.013%，其他雜質(zhì)的絕對偏差均小于0.005%，總雜質(zhì)的絕對偏差為0.015%，在4小時(shí)內(nèi)未見新增雜質(zhì)產(chǎn)生；即樣品溶液在室溫條件下4小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。低溫條件（2～8℃）：樣品溶液在24小時(shí)內(nèi)雜質(zhì)A變化的絕對偏差為0.008%，總雜質(zhì)的絕對偏差為0.008%，在24小時(shí)內(nèi)未見新增雜質(zhì)產(chǎn)生；即樣品溶液在低溫條件下24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。各已知雜質(zhì)的回收率各雜質(zhì)回收率及RSD分別為：雜質(zhì)A：回收率為99.9%，RSD為1.08%；雜質(zhì)B：回收率為99.0%，RSD為0.87%；雜質(zhì)C：回收率為99.3%，RSD為1.31%；雜質(zhì)D：回收率為99.6%，RSD為0.85%；雜質(zhì)E：回收率為99.4%，RSD為1.10%；雜質(zhì)J：回收率為99.6%，RSD為0.53%；雜質(zhì)L1+L2：回收率為99.8%，RSD為0.93%；雜質(zhì)Q：回收率為100.8%，RSD為0.75%。耐用性色譜柱：Agilent ZorbaxXDB-C18柱，250*4.6mm，5μm；Welchrom C18，250*4.6mm，5μm。流速：1.0±0.05ml/min；柱溫：40℃±5℃；初始流動(dòng)相比例：甲醇-乙腈-0.1%醋酸=（25±2）:3:（72±2）的微小變化對檢測結(jié)果無影響，各雜質(zhì)的相對保留時(shí)間比較穩(wěn)定，變化均在±0.05范圍內(nèi)。

結(jié)語

通過卡培他濱中有關(guān)物質(zhì)的專屬性、系統(tǒng)適用性、低濃度線性、各已知雜質(zhì)的回收率、各已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)的檢出限、定量限以及未檢出的已知雜質(zhì)的檢出限加入試驗(yàn)、精密度測定、溶液穩(wěn)定性考察和耐用性考察試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)表明該色譜條件專屬性強(qiáng)、低濃度線性關(guān)系好、檢出靈敏度高，精密度好，溶液室溫4小時(shí)穩(wěn)定，在低溫條件下（2℃～8℃）24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，且各已知雜質(zhì)測定的準(zhǔn)確度高，色譜系統(tǒng)在流速（1.0±0.05ml/min）、柱溫（40±5℃）、流動(dòng)相比例[流動(dòng)相：0.1%醋酸-甲醇-乙腈=72:（25±2）:5，]的微小變化下，不影響有關(guān)物質(zhì)的測定結(jié)果，各已知雜質(zhì)相對保留時(shí)間穩(wěn)定，系統(tǒng)適用性符合測定要求，上述條件耐用性好。可用卡培他濱原料藥和制劑的有關(guān)物質(zhì)檢查，進(jìn)行質(zhì)量控制，也可為其它氟化嘧啶類物質(zhì)研究提供參考。