梗阻性無精子癥患者ICSI助孕前藥物干預效果觀察

何泳志，李大文，成俊萍，潘琪

(廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021)

近年來梗阻性無精子癥(OA)的發病率逐年升高。OA多為炎性梗阻，炎癥反應致精子質量下降可能是其妊娠率低的原因之一。卵胞漿內單精子注射術(ICSI)是目前治療OA的主要方法，但妊娠率僅為30%～50%[1]。目前國內大部分生殖中心對OA患者行ICSI助孕前不給予藥物干預，藥物干預對OA患者行ICSI治療后妊娠結局的影響鮮見報道。脂質代謝參與精子與卵母細胞結合，并影響胚胎質量。左卡尼汀具有抗氧化作用，可調控脂質代謝，改善精子質量。本研究探討OA患者ICSI助孕前給予左卡尼汀干預對妊娠結局影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1～11月我院收治的OA患者及其配偶136對，男方年齡(28.43±2.19)歲，睪酮(524.35±91.37)ng/dL，FSH(7.29±2.28)IU/L，睪丸體積(29.94±2.03)mL；女方生殖功能均良好，年齡(27.53±2.32)歲，獲卵數(10.31±3.59)個，左側竇卵泡數(7.25±1.29)個、右側竇卵泡數(7.18±1.24)個。OA的診斷標準：經3次或3次以上精液常規檢查并經過離心后確認，精子數均為0；FSH基本正常；睪丸活檢中存在精子；睪丸體積>30 mL或單側體積>15 mL。納入標準：符合OA診斷標準；男性年齡20～40歲，女性年齡20～38歲；女方月經來潮2～4天查性激素及B超檢查竇卵泡情況示卵巢功能正常；女方通過長方案超促排卵取出卵子>5個。排除標準：夫婦雙方近期高熱或有手術麻醉史；具有家族遺傳病史或染色體異常；具有吸煙、酗酒或吸毒等不良嗜好；患有不宜生育的疾病。將研究對象隨機分為干預組71對和對照組65對，兩組男女雙方基本資料均具有可比性。

1.2 治療方法 干預組OA患者服用左卡尼汀口服液1.0 g，2次/d；對照組不給予任何藥物。連續服藥3個月結束時，在女方取卵當天所有OA患者均行經皮附睪精子抽吸術(PESA)取精、ICSI助孕。具體方法：①促排卵和采卵：兩組女方均行控制性促排卵和采卵。促排卵采用常規促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案，即從前一個月經周期21日起皮下注射GnRH-a行降調節，當達到降調節的相關指標后，增用促性腺激素(Gn)誘導卵泡發育。如果有2個主導卵泡直徑≥18 mm，停止使用GnRH-a和Gn，根據患者具體情況當晚肌注人絨毛膜促性腺激素(HCG)，給藥36 h于手術室在陰道B超引導下行經陰道超聲穿刺取卵。將獲得的卵母細胞放在37 ℃、5% CO2培養箱中培養4～6 h以備行ICSI。卵母細胞受精前于顯微鏡下觀察其成熟情況，處在分裂中期Ⅱ(MⅡ)的卵細胞視為成熟卵細胞。②PESA：OA患者取仰臥位，常規消毒、鋪巾。采用5 mL注射器吸入少量培養液，直視下用4號半針頭經皮穿刺附睪，負壓抽吸至有淡黃色渾濁液體抽出。如未見液體被抽出，可改變穿刺方向重復抽吸。將抽吸出的液體注入含精子洗滌液的培養皿，于倒置顯微鏡下尋找并取出活動的成熟精子。③ICSI：取MⅡ期的成熟卵細胞行單精子顯微注射。注射后16～18 h觀察受精情況，48 h觀察卵裂情況，48～72 h選取優質胚胎由生殖醫生行胚胎移植。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 精子DNA斷裂率(DFI)、頂體完整率及自發頂體反應率 分別于治療前及給藥3個月結束、女方取卵當天對OA患者行睪丸活檢并取出精子，檢測精子DNA完整率、精子頂體完整率及精子自發頂體反應率。精子DFI檢測：采用精子染色質擴散試驗。將獲得的精子接種于4孔皿，接種密度為5×105個/mL。隨機計數400個精子觀察精子光暈大小。根據光暈與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無光暈4個等級，大和中光暈表示精子DNA完整無碎片，小和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。判斷標準：精子頭直徑≤1/4為小光暈，1/4<精子頭直徑≤2/3為中光暈，精子頭直徑>2/3為大光暈。以精子DFI表示精子DNA完整率。精子頂體完整率及精子自發頂體反應率檢測：將獲得的精子置于450～490 nm激發光下于400倍油鏡下觀察，判斷精子頂體完整性。判斷標準：頂體完整：精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻；頂體反應：精子僅在赤道帶出現熒光帶，或者在頂體區根本沒有熒光染色；頂體異常：除上述兩類精子外的所有其他精子。隨機計數200個精子，計算精子頂體完整率及精子自發頂體反應率。

1.3.2 受精率、卵裂率、優質胚胎率和臨床妊娠率 行ICSI后第1天觀察卵子受精情況，以雙原核(2PN)卵子作為正常受精卵。行ICSI第3天遵循Peter分級原則選擇優質胚胎(Ⅰ級和Ⅱ級)或囊胚進行移植，胚胎移植的數量不超過3個，其他Ⅱ級以上胚胎經患者知情同意后凍存，剩余胚胎經患者同意后予以醫學丟棄，在此過程中女方給予黃體酮支持。移植術后14天若女方血β-HCG為陽性，則在移植術后第35天進行B超觀察宮腔內孕囊數目和胎心搏動以判斷是否臨床妊娠。統計女方受精率、卵裂率、優質胚胎率和臨床妊娠率。受精率=正常受精數/獲卵數×100%；卵裂率=正常卵裂胚胎數/正常受精卵數×100%；優質胚胎率=優質胚胎數/總胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數/總例數×100%。

2 結果

2.1 兩組OA患者精子DFI、頂體完整率及自發頂體反應率比較 干預組治療后精子DFI及自發頂體反應率均低于治療前及對照組治療后，精子頂體完整率均高于治療前及對照組治療后，組間及組內比較P均<0.01；對照組治療前后三項指標比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組OA患者精子DFI、頂體完整率及自發頂體反應率比較

注：與同組治療前比較，*P<0.01；與對照組治療后比較，△P<0.01。

2.2 兩組女方受精率、卵裂率、優質胚胎率和臨床妊娠率比較 干預組共獲得748個卵子，正常受精卵679個，正常卵裂胚胎672個，優質胚胎311個，臨床妊娠33例；對照組共獲得663個卵子，正常受精卵557個，正常卵裂胚胎550個，優質胚胎195個，臨床妊娠23例。干預組受精率、優質胚胎率均高于對照組(P均<0.01)，兩組卵裂率、臨床妊娠率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 兩組女方受精率、卵裂率、優質胚胎率和臨床妊娠率比較(%)

注：與對照組比較，*P<0.01。

3 討論

OA在生殖醫學領域是造成難治性男性不育的原因之一。ICSI技術的成功應用使廣大OA患者實現了生育愿望[4]。生殖系統炎癥如陰囊炎、附睪炎、精囊炎、睪丸炎、前列腺炎等均可能導致精路梗阻，慢性附睪炎可導致附睪纖維化、功能喪失，長期梗阻淤積導致氧化應激損傷，抑制附睪內精子發育成熟；附睪內炎性物質、淤血及組織碎片等均會導致精子損傷。因此OA患者附睪精子質量較正常患者有所下降[5,6]。但OA患者附睪精子質量下降這種情況在人類輔助生殖過程中尚未引起生殖科醫師的重視，目前大多數生殖中心對于OA患者行ICSI助孕前不予藥物進行干預。

卡尼汀又稱肉毒堿或肉堿，在人體內可以通過自身合成滿足生理代謝的需求。卡尼汀有三種光學旋光體，即右旋D型、左旋L型及外消旋化DL型，惟有左旋L型卡尼汀即左卡尼汀具有生理活性。左卡尼汀可競爭性抑制肉堿脂肪酰轉移酶(PTC)活性和肉堿乙酰轉移酶(CAT)活性，阻礙人類細胞的脂肪代謝過程[7]，在卵母細胞成熟、精卵結合過程和胚胎培養過程中均發揮重要作用[7,8]。精子頂體質量是評價精子質量的常用指標[9]。評價精子頂體是否缺陷的主要指標包括精子頂體完整率及精子頂體酶水平。男性不育的重要原因之一就是精子頂體缺陷導致頂體不完整[10]。相關研究發現，精子頂體基質可以發揮支架作用，當精子發生頂體反應時可以釋放及控制與精子頂體相關的蛋白質。精子頂體基質位于精子頭部，可以和卵母細胞周圍的透明帶進行相互作用，當精子發生頂體反應時即使相關蛋白被水解，精子頂體還能繼續保持穩定性。在受精過程中發生頂體反應是一個基本步驟，頂體膜和細胞質膜混合形成的囊泡在細胞外釋放頂體酶，頂體酶覆在精子頭部，并使精子穿透卵母細胞進行受精[11,12]。

本研究對OA患者在行ICSI助孕前應用左卡尼汀進行干預，3個月后采用PESA取出附睪精子行ICSI助孕，結果發現藥物干預組OA患者精子DNA完整率與精子頂體完整率均高于對照組，精子頂體自發反應率顯著低于對照組。提示左卡尼汀可能通過抗氧化應激作用改善精漿內環境，促進相關蛋白表達，有利于改善精子能動性；左卡尼汀應用于OA患者可以改善其附睪精子染色質的質量，提高精子DNA完整性。由于精子頂體不完整、頂體酶缺陷及精漿內存在氧化應激的環境導致精子在未受精前發生頂體反應，進而影響精子受精和精卵融合；左卡尼汀具有抗氧化應激等作用，可提高精子的頂體完整性，繼而降低精子頂體自發反應[13]。本研究中干預組女方受精率與優質胚胎率優于對照組，提示左卡尼汀可能通過提高OA患者附睪精子的功能及質量包括精子能動性、精子DNA完整性及頂體完整性等提高受精率及優質胚胎率。

綜上所述，OA患者行ICSI前給予藥物輔助治療可提高精子質量，改善臨床妊娠結局。