SMAD基因家族PCR引物設(shè)計及其在非小細胞肺癌中的表達

林高陽，高大登，袁方，劉振波

(青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)療集團，山東青島266033)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外酶促合成、擴增特定基因或DNA片段的方法，已在多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如基因分離、克隆、核酸序列分析、胎兒性別鑒定、癌癥治療監(jiān)控、基因突變檢測等。近年來，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)對轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/SMAD信號通路及SMAD基因家族與各種疾病的研究不斷升溫，SMAD基因家族的PCR檢測技術(shù)應(yīng)用也更加廣泛。引物設(shè)計是影響PCR試驗的重要參數(shù)之一，一對高度有效的基因引物序列可以更好地檢測基因表達變化。目前，雖然引物設(shè)計軟件的功能趨于完善，但關(guān)于計算機引物設(shè)計程序的文獻還不多。2017年1～12月，本研究以SMAD基因家族引物設(shè)計為例，對引物設(shè)計原則和軟件引物設(shè)計的方法進行了分析，同時應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測SMAD基因家族在人正常支氣管上皮細胞系BEAS-2B和非小細胞肺癌A549、SK-MES-1、H1299中的表達變化，旨在為進一步研究SMAD基因提供條件。

1 材料

人正常支氣管上皮細胞系BEAS-2B，肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1299，肺鱗癌細胞系SK-MES-1均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection. ATCC，Manassas, VA, USA)；TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR檢測試劑盒購自TaKaRa生物科技公司；SMAD基因家族引物自主設(shè)計，堿基序列由華大生物科技有限公司合成，應(yīng)用Applied Biosystems(ABI)7900 Fast Real-Time PCR System進行檢測。

2 方法與結(jié)果

2.1 SMAD基因家族(SMAD1～SMAD8)特異引物設(shè)計及驗證 在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索SMAD1～SMAD8基因序列，應(yīng)用Premier Primer5.0軟件，按照引物設(shè)計的基本原則進行引物設(shè)計。引物設(shè)計流程：獲取SMAD基因序列(NCBI、Gramene、EBI等)；序列編輯與整理(明確SMAD家族成員的可變剪切體數(shù)目)；確定引物設(shè)計的位置蛋白質(zhì)編碼(CDS)區(qū)；引物特異比對及綜合評價(BLAST、Oligo6.0等)；引物合成；PCR擴增試驗驗證(擴增曲線、溶解曲線、凝膠成像等)。SMAD1～8基因分別設(shè)計了兩對引物，引物序列見表1。引物驗證結(jié)果見圖1、2。通過對SMAD基因家族引物進行上述驗證，確定SMAD1-1、SMAD2-1、SMAD3-1、SMAD4-2、SMAD5-1、SMAD6-1、SMAD7-1、SMAD8-2引物的擴增效率更高、特異性更強。

表1 SMAD基因家族PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度

2.2 SMAD1～SMAD8在非小細胞肺癌中的表達變化 將人正常支氣管上皮BEAS-2B細胞采用Keratinocyte Supplementary Free Medium培養(yǎng)基在，37 ℃、5% CO2孵箱中孵育培養(yǎng)。人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1299和肺鱗癌細胞系SK-MES-1用含有10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。應(yīng)用TRIzol法提取各細胞的總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶按照Takara試劑盒使用說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。所得cDNA置于-20 ℃保存。采用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測各細胞SMAD1～SMAD8 mRNA表達，所選引物分別為SMAD1-1、SMAD2-1、SMAD3-1、SMAD4-2、SMAD5-1、SMAD6-1、SMAD7-1、SMAD8-2。

圖1 SMAD基因家族引物PCR擴增曲線

圖2 SMAD基因家族引物PCR溶解曲線

以正常支氣管上皮BEAS-2B細胞中SMAD1表達量為基準(zhǔn)(校正RQ約為1)，SMAD2相對表達量為6.590±0.459、SMAD3為10.977±0.312、SMAD4為4.651±0.115、SMAD5為16.762±0.389、SMAD6為3.248±0.108、SMAD7為2.007±0.012、SMAD8為1.144±0.103，均較SMAD1表達升高，其中SMAD5表達最高，SMAD3次之。由此可以推測，SMAD5、SMAD3在正常支氣管上皮細胞中可能具有維持細胞生物學(xué)穩(wěn)定的功能。

SMAD2、SMAD4、SMAD5、SMAD6、SMAD7、SMAD8在肺腺癌A549、H1299細胞及肺鱗癌SK-MES-1細胞中的表達均較人正常支氣管上皮BEAS-2B細胞降低；在H1299、SK-MES-1細胞中SMAD1表達較BEAS-2B和A549細胞增加，且在A549細胞中SMAD1表達較BEAS-2B細胞下降；在SK-MES-1細胞中SMAD3表達增加，且在H1299、A549細胞中SMAD3表達較BEAS-2B細胞下降；在H1299細胞中SMAD2、SMAD6、SMAD7表較其他三種細胞均下降；各細胞間比較P<0.05或<0.01。見表2。

表2 各種細胞中SMAD1～ SMAD8表達

3 討論

PCR又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性及敏感性高、操作簡便、省時等特點。PCR擴增時需要引物。在準(zhǔn)備設(shè)計基因引物前，要清楚地認(rèn)識實驗研究的目的和意義，通過查閱文獻，明確該基因的相關(guān)研究理論；明確是否要進一步用于克隆或表達。如果需要克隆，引物5′端最好加上限制性內(nèi)切酶的酶切位點，加入的酶切位點不能與引物內(nèi)部形成互補結(jié)構(gòu)，并且所選擇的酶切位點盡量為多克隆位點的中間酶切位點，且載體的其他位置應(yīng)盡量無該酶切位點。如此構(gòu)建新的質(zhì)粒時可供選擇的內(nèi)切酶空間更大，并保證所需擴增的DNA序列中無該酶切位點，為日后研究該基因的后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。目前，進行引物設(shè)計時模板選擇有兩種情況：一種是擴增已知基因，需要在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中搜索相同物種該基因的DNA或者mRNA作為模板來設(shè)計引物；另一種是擴增未知基因，需根據(jù)比較基因組定位的原理，選擇研究深入的高等動植物保守的功能基因的DNA或者mRNA序列為模板來設(shè)計引物。雖然引物設(shè)計模板選擇有很多種，但是無論何種情況，都要涉及引物設(shè)計軟件。當(dāng)前進行引物設(shè)計的國際三大核酸數(shù)據(jù)庫分別為NCBI、DDBJ、EMBL，生物軟件有BlockMaker、CodeHop、clustalW2、VectorNTISuit、Dnasis Omiga、Dnastar、DNAMAN、Oligo6.0等[1]。設(shè)計引物的軟件一般均具有引物自動搜索功能，不同軟件側(cè)重點有所不同，自動搜索的結(jié)果也不同。一般以Premier Primer5.0功能最強且方便使用，其次是Oligo6.0。要想得到效果好的引物，在自動搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。本研究中我們采用以上方法成功設(shè)計出SMAD基因家族引物序列，通過對引物序列進行PCR擴增檢測，根據(jù)溶解曲線、擴增曲線及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析，選擇在相同溫度下，擴增曲線擬合度較一致且曲線定點斜率大，表示擴增效率高、特異性好的引物序列；溶解曲線擬合度較一致且溶解溫度穩(wěn)定，溶解曲線峰值較高，表示引物和擴增片段間能夠很快解鏈并能夠很快結(jié)合擴增，進而更能實現(xiàn)特異引物與目的基因模板序列間高效和特異擴增。瓊脂糖凝膠電泳是對擴增產(chǎn)物的一種檢測方法，根據(jù)目的片段基因CDS區(qū)堿基對的大小，可通過瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測擴增片段的條帶是否為我們所設(shè)計的目的基因片段，條帶亮度也能判定擴增的目前基因的數(shù)量，間接反映擴增效率。結(jié)合以上設(shè)計分析過程，本研究成功設(shè)計并鑒定出擴增效率高、特異性高的針對目的基因SMAD基因家族的引物序列。

TGF-β/SMAD信號通路是一條重要的生物信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TGF-β是一種重要的細胞因子，廣泛參與細胞的分化、增殖、形態(tài)改變、黏附、轉(zhuǎn)移及凋亡。TGF-β超家族成員通過膜受體介導(dǎo)將信號傳入細胞內(nèi)，其下游最主要的信號蛋白SMAD在細胞內(nèi)通過不同的方式參與各種基因的表達調(diào)控。SMAD是將TGF-β信號傳至細胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵分子，參與細胞增殖、轉(zhuǎn)化、合成、分泌、凋亡等一系列生物學(xué)功能。但目前TGF-β/SMAD信號通路在肺癌中的作用尚不十分清楚，SMAD基因家族在非小細胞肺癌中的表達變化及主要功能目前尚未見報道。

SMAD蛋白是在小鼠與人類細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一類蛋白質(zhì)[2]，因果蠅中相對應(yīng)的蛋白質(zhì)名為Mad而得名。人SMAD基因位于15q22.31-q23及18q21.1染色體區(qū)域，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)SMAD蛋白家族包括SMAD1～9[3]。根據(jù)SMAD蛋白結(jié)構(gòu)和功能不同可分為三類[4]：第一類是受體調(diào)節(jié)型SMAD蛋白(RR-SMAD)，是TGF-β家族受體激酶的直接底物；包括SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、SMAD8、SMAD9。其中SMAD2、SMAD3分子C-末端具有特征性絲氨酸序列，可被活化的TRI磷酸化，決定了配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性，是參與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)分子。研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌組織SMAD2基因高表達會影響患者預(yù)后[5]；SMAD2蛋白對TGF-β1/SMAD3介導(dǎo)的肝纖維化具有保護作用[6]。第二類為共同調(diào)節(jié)型SMAD 蛋白(Co-SMAD)即SMAD4，可通過受體磷酸化的SMAD蛋白參與TGF-β、活化素和BMP的信號傳導(dǎo)[7]。Co-SMAD是TGF-β/SMAD信號通路信息傳遞的共用分子[8]，在參與和調(diào)節(jié)TGF-β超家族后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面必不可少。對于上皮組織起源的細胞，SMAD4蛋白核移位可直接誘導(dǎo)細胞凋亡，對于控制細胞的增殖可能起重要作用。由于SMAD4蛋白的C-端缺乏SSXS motif結(jié)構(gòu)，SMAD4蛋白不結(jié)合也不受TGF-β刺激而發(fā)生磷酸化，但可結(jié)合或穩(wěn)定其他SMAD復(fù)合體[9]，因此SMAD4是具有協(xié)同作用的蛋白，SMAD2、SMAD3與SMAD4 可協(xié)同誘導(dǎo)TGF-β并刺激其他基因的表達；同時將SMAD2與SMAD4的C-端截除得到的蛋白質(zhì)則是TGF-β信號傳遞的抑制劑；另外研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4也是腫瘤抑制候選基因，在乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌和胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)其基因表達異常[10～12]。第三類是抑制型SMAD蛋白(I-SMAD)，包括SMAD6、SMAD7。SMAD7與SMAD泛素化調(diào)節(jié)因子(Smurf)共同參與SMAD4降解[13]；可募集Smurf至TGF-β受體，誘導(dǎo)TGF-β受體的降解，進而抑制TGF-β/SMAD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)效應(yīng)[14]。SMAD7基因位于染色體18q21，屬于抑制型SMAD，不能被受體磷酸化，但可與活化的TGF-β受體1牢固結(jié)合，阻止RR-SMAD磷酸化，從而對該超家族信號傳遞起負調(diào)控作用。SMAD7表達紊亂可影響細胞對TGF-β的應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，在成人T細胞白血病和淋巴瘤中SMAD7表達上調(diào)[15]；在胃癌和甲狀腺癌中也發(fā)現(xiàn)SMAD7表達上調(diào)[16,17]；提示SMAD7表達異常可促進腫瘤的發(fā)生。

本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測正常支氣管上皮細胞系BEAS-2B，肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1299及肺鱗癌細胞系SK-MES-1中SMAD基因家族表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常肺支氣管上皮細胞中SMAD2、SMAD3、SMAD5基因高表達，SMAD5表達最高；在非小細胞肺癌細胞系中，肺腺癌A549細胞中SMAD基因家族表達情況較正常支氣管上皮細胞SMAD基因家族表達水平普遍偏低，以SMAD5、SMAD8降低最為明顯；上述結(jié)果提示，SMAD5可能在肺腺癌A549癌性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。在肺腺癌H1299、肺鱗癌SK-MES-1中同樣發(fā)現(xiàn)SMAD5低表達，提示SMAD5可能參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展。在肺鱗癌SK-MES-1細胞系中SMAD3高表達，而在正常支氣管上皮中SMAD3已存在相對高表達，提示SMAD3可能與上皮相關(guān)性疾病相關(guān)。上述結(jié)果提示，SMAD基因家族在不同細胞系尤其是正常細胞和癌性細胞系中的表達變化具有明顯的不同；在不同病理類型的肺癌細胞系中，SMAD基因表達變化與病理類型具有相關(guān)性。

本研究初步明確了人正常肺支氣管上皮細胞向癌癥方向發(fā)生、發(fā)展中變化明顯的SMAD基因，為后續(xù)深入研究TGF-β/SMAD信號通路、肺癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵SMAD基因以及TGF-β/SMAD信號通路在肺癌發(fā)生中的具體作用提供了方向，也為Primer Bank引物序列數(shù)據(jù)庫填補了檢測SMAD基因家族的高效特異引物序列。