大腸癌組織P-糖蛋白、核轉錄因子κB p65表達及意義

杜夢楠 ，程玉，袁亞男，嚴曉麗，鄭紀寧

(承德醫學院，河北承德 067000)

腫瘤細胞對化療藥物耐藥是影響化療效果的主要原因[1]。P-糖蛋白(P-gp)是一種跨膜糖蛋白，具有能量依賴性“藥泵”功能，又稱為ATP能量依賴性藥物輸出泵。其既能與藥物結合,又能與ATP結合，可將細胞內藥物泵至細胞外，從而降低藥物在細胞內的蓄積，導致化療效果下降[2,3]。核轉錄因子κB(NF-κB)是一種能夠影響細胞生存、變異和增殖的重要核轉錄因子，可被血清、胰島素、生長因子、放射線、化療藥物等刺激因子激活[4]。研究證實，NF-κB信號通路在腫瘤的發生、發展和浸潤轉移中起重要的調控作用[5,6]。NF-κB p65是 NF-κB家族中的重要因子。本研究探討大腸癌組織P-gp、NF-κB p65表達變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014～2017年承德醫學院附屬醫院收治的大腸癌患者69例，男46例、女23例，年齡35～81歲、中位年齡56.1歲，結腸癌32例、直腸癌37例，均行大腸癌根治術。術前均未行放化療及生物免疫性治療；術后病理診斷腫瘤為高分化21例、中分化30例、低分化18例，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期25例、Ⅲ+Ⅳ期44例，伴淋巴結轉移44例。

1.2 大腸癌組織及癌旁正常組織P-gp、NF-κB p65表達檢測 采用免疫組化SP法。術中留取69例患者手術切除的癌組織，其中41例留取癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)。將癌組織及癌旁正常組織均給予10%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片；切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鈉修復液微波100 ℃ 6 min、80 ℃ 6 min抗原修復，3%過氧化氫溶液37 ℃溫箱孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，山羊抗血清37 ℃封閉30 min；滴加鼠抗人P-gp單克隆抗體(濃度1∶100)、兔抗人NF-κB p65單克隆抗體(濃度1∶200)，4 ℃過夜，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次；DAB顯色，封片。以PBS替代一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。P-gp主要表達于細胞膜和細胞質，呈黃色或棕黃色顆粒；NF-κB p65主要表達于細胞質，部分表達于細胞核，呈黃色或棕黃色細顆粒狀。隨機選取5個高倍鏡(×400)視野，觀察陽性細胞染色強度和陽性細胞所占比例。按陽性細胞所占的百分比評分：陽性細胞數<5%為0分，5%～24%為1分，>24%～49%為2分，>49%～74%為3分，>74%為4分。按染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項相加后分為4級，0～1分為-，2分為+，3～4分為++，>5 分為+++。+～+++均為陽性。分析大腸腺癌患者P-gp、NF-κB p65表達與患者臨床病理參數的關系。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗或Mann-WhitneyU檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌組織及癌旁正常組織P-gp、NF-κB p65表達比較 癌組織及其癌旁正常組織P-gp陽性表達率分別為89.9%(62/69)、24.4%(10/41)；NF-κB p65陽性表達率分別為84.1%(58/69)、19.5%(8/41)；P均<0. 05。見表1。

表1 大腸癌組織及癌旁正常組織P-gp、NF-κB p65表達(例)

2.2 大腸癌組織P-gp、NF-κB p65陽性表達與患者臨床病理參數的關系 大腸癌組織P-gp陽性表達與腫瘤分化程度、浸潤深度相關(P均<0.05)，NF-κB p65陽性表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移相關(P均<0.05)。見表2。

表2 大腸癌組織P-gp、NF-κB p65陽性表達與患者臨床病理參數的關系

2.3 大腸癌組織P-gp表達和NF-κB p65表達的關系 大腸癌組織P-gp陽性51例，其中NF-κB p65陽性41例、陰性10例；P-gp陰性18例，其中NF-κB p65陽性5例、陰性13例。Spearman相關分析顯示，大腸癌組織P-gp表達和NF-κB p65表達呈正相關(r=0.490，P<0.05)。

3 討論

研究證實，多種因子參與了腫瘤細胞耐藥[7]，多藥耐藥基因1(MDR1)編碼蛋白P-gp是目前研究最多的耐藥相關蛋白。P-gp是分子量約為170 kD的跨膜糖蛋白，由位于染色體7q21的人類MDR1基因編碼[8]。P-gp由兩個疏水域組成，其中包括由跨膜α-螺旋組成的藥物結合領域，參與運送毒素和外來化合物進出細胞[9]。細胞質中的兩個核苷酸結合域負責將ATP水解與傳輸過程耦合起來，可通過ATP水解獲得能量，將化療藥物泵出細胞外從而影響化療效果。P-gp是與 MDR 相關的藥物轉運體之一，P-gp抑制劑可能成為逆轉多藥耐藥的藥物[10～12]。但P-gp與腫瘤發生發展關系的報道鮮見。

NF-κB是一種廣泛存在和功能多樣的轉錄因子，廣泛存在于多種組織細胞中，具有多向調節功能。其不僅可促進腫瘤細胞的增殖與分化，還可促進腫瘤血管生成。至今在哺乳動物細胞中發現有五種NF-κB，包括p50、p52、RelA、RelB、CRel[13]。其中p50和p65是NF-κB 家族中最重要的兩個因子，通常情況下在胞質中的NF-κB p65處于失活狀態，與抑制蛋白IkB和p50結合形成三聚體。機體內NF-κB的活化受到精密調控，當受到外界因子如炎癥因子、藥物、紫外線等刺激時，IkB隨即從三聚體中解離出來，經泛素化修飾后通過蛋白酶解體，使受到IkB抑制的NF-κB p65暴露其核定位序列，迅速從細胞質進入核內，與核內的特定序列結合，從而啟動相關基因的轉錄[14]。

研究發現，NF-κB在細胞增殖、凋亡等方面發揮重要作用。miR-9可通過調節 NF-κB抑制卵巢癌和胃癌細胞的生長[15]；miR-195能負向調節IKK表達，從而降低肝癌細胞中NF-κB活性[16]；miR-199a和miR-214均受Twist1調控，能激活IKKβ/NF-κB和PTEN/ATK途徑，進而影響卵巢上皮癌干細胞的分化[17～19]。

本研究結果顯示， 大腸癌組織P-gp和NF-κB p65陽性表達率均高于癌旁正常組織，表明二者過表達參與了大腸癌的發生。進一步研究發現，P-gp表達與大腸癌分化程度、浸潤深度有關，NF-κB p65表達與大腸癌分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移有關；表明二者參與了大腸癌的發展。大腸癌組織中P-gp和NF-κB p65表達呈正相關，說明二者協同調控大腸癌的發生、發展。

綜上所述， P-gp與NF-κB p65可促進大腸癌的發生、發展，二者起協同作用；但二者作用的具體機制有待進一步研究。