Eya2基因沉默對前列腺癌細胞生物學行為的影響及其機制

劉重遠

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004)

Eya家族是一個進化上比較保守的基因家族，因其特有的C端編碼271個氨基酸的保守性較高的Eya結構域而得名[1,2]。目前已物Eya基因包括Eya1～Eya3[3，4]。Eya基因編碼的蛋白質是一類重要的基因轉錄調控因子，參與調控細胞中多條重要信號通路[4～6]。Eya2是Eya家族的重要成員之一，在人類多種惡性腫瘤的發生中發揮原癌基因作用。研究發現，Eya2轉基因小鼠中PI3K/蛋白激酶B(AKT)/mTOR級聯信號通路活性增強[7]，而在前列腺癌細胞中Eya2是否對該通路有影響尚未明確。2016年10月～2017年11月，本研究觀察了Eya2基因沉默對前列腺癌細胞生物學行為的影響，現分析結果并探討其機制是否與AKT信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：正常前列腺上皮細胞RWPE-1及前列腺癌細胞PC-3、DU145、LNCAP均購于美國模式培養物保藏中心。主要試劑：RPMI 1640培養基、FBS、胰蛋白酶均購于美國賽默飛世爾公司，細胞裂解液、ECL發光液均購于美國Millipore公司，MTT溶液、吉薩姆染色液、多聚甲醛、蘇木精染色液、Annexin V/PI染色試劑盒均購于寶生物工程(大連)有限公司；Eya2 siRNA購于廣州銳博生物科技有限公司，干擾試劑DharmaFECT1購于美國GE Dharmacon公司。主要儀器：磁力攪拌器、電子天平均購于梅特勒-托利多公司，超純水系統購于美國Millipore公司，電泳儀、轉印槽均購于美國Bio-Rad公司，凝膠成像系統購于以色列DNR公司，超凈工作臺、超聲波破碎儀、酶標儀、流式細胞儀均購于美國賽默飛世爾公司，恒溫培養箱購于日本三洋公司，倒置顯微鏡購于日本奧林巴斯公司。

1.2 細胞培養 將正常前列腺上皮細胞RWPE-1及前列腺癌細胞PC-3、DU145、LNCAP復蘇后，以5×103個/孔均勻接種于6孔培養板中。37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養，細胞融合至約90%時，加入0.25%胰蛋白酶進行消化，收集消化后的細胞用于以下實驗。

1.3 正常前列腺上皮細胞與前列腺癌細胞Eya2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集正常前列腺上皮細胞RWPE-1及前列腺癌細胞PC-3、DU145、LNCAP，加入適量的裂解液，冰上靜置10 min。將細胞混合液用超聲波破碎儀進行破碎，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，所得上清液即為樣本的總蛋白提取液。采用酶標儀對目標蛋白進行定量，與蛋白上樣緩沖液進行混合。將蛋白混合液于沸水浴中煮沸5 min，并于室溫下冷卻。蛋白上樣量為10 μL，上樣結束后接通電源，調整電壓為120 V，完成電泳。電泳結束后將目的蛋白轉印于PVDF膜上，并進行非特異性蛋白封閉。加入一抗Eya2、GAPDH(稀釋倍數分別為1∶1 000、1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000)，37 ℃孵育2 h。將ECL發光液均勻滴加在PVDF膜上，進行底物發光，并通過凝膠成像儀記錄和保存。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值計算Eya2相對表達量。結果顯示，RWPE-1及PC-3、DU145、LNCAP細胞Eya2蛋白相對表達量分別為0.22±0.01、1.12±0.02、0.84±0.01、0.67±0.01， PC-3、DU145、LNCAP細胞Eya2蛋白相對表達量均高于RWPE-1細胞(P均<0.05)。PC-3細胞Eya2蛋白相對表達量高于DU145、LNCAP細胞。本研究選擇PC-3細胞進行后續實驗。

1.4 Eya2基因沉默及其對PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲能力影響的觀察

1.4.1 Eya2基因沉默及效果 取對數生長期的前列腺癌細胞PC-3，制備細胞懸液，以5×103個/孔均勻接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養。待細胞生長成為單層貼壁狀態后，隨機分為沉默組和對照組，每組3個復孔。沉默組和對照組分別通過DharmaFECT 1轉染試劑轉染Eya2 siRNA、Negative siRNA，轉染24 h后收集細胞并檢測Eya2表達。①Eya2蛋白表達：采用Western blotting法。取兩組轉染24 h細胞，參照1.3的方法檢測兩組Eya2蛋白相對表達量。②Eya2 mRNA表達：采用實時熒光定量PCR法。取兩組轉染24 h細胞，加入TRIzol試劑提取總RNA，使用PrimeScript RT Master mix試劑盒逆轉錄合成cDNA。應用SYBR Green Master Mix Kit試劑盒及ABI 7500實時定量PCR儀進行PCR反應。Eya2引物序列：上游：5′-TCTCACCCAGCCTCACTGTAAAC-3′，下游：5′-TC-AGAGTCCACACAGCAGCGTC-3′。內參基因β-actin引物序列：上游：5′-CCAACCGCGAGAAGATGACC-3′，下游：5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。采用2-ΔΔCt法計算Eya2 mRNA相對表達量，實驗重復3次。結果顯示，沉默組與對照組Eya2蛋白相對表達量分別為0.630±0.012、0.800±0.009，Eya2 mRNA相對表達量分別為0.360±0.006、1.030±0.005，沉默組Eya2蛋白和mRNA相對表達量均低于對照組(P均<0.05)。證實成功沉默PC-3細胞中的Eya2基因表達。

1.4.2 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。取1.4.1中兩組轉染24 h細胞，以5×103個/孔均勻接種于96孔培養板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37 ℃條件下培養4 h；去除培養基，每孔加入150 μL DMSO。采用酶標儀檢測波長為490 nm處的光密度(OD)值，以OD490值表示細胞增殖能力。連續檢測5天。

1.4.3 細胞凋亡情況檢測 采用流式細胞術。取1.4.1中兩組轉染24 h細胞，PBS緩沖液漂洗。用250 μL PBS緩沖液將細胞進行重懸，1%多聚甲醛固定。加入5 mg/mL碘化丙啶及Annexin V/FITC，避光條件下染色15 min。將經過染色的細胞通過流式細胞儀進行檢測，軟件分析活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞以及死亡細胞數量，計算細胞凋亡率。

1.4.4 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。取1.4.1中兩組轉染24 h細胞加入到Transwell上室中，下室加入含15% FBS的DMEM培養基，37 ℃條件下培養16 h。將未穿過基質膠的細胞用棉簽輕輕擦去，將穿過基質膠的細胞用4%多聚甲醛進行固定，蘇木精染色。200倍顯微鏡下隨機選取5個視野，計數穿過基質膠的細胞數，取平均值，以穿膜細胞數表示細胞侵襲能力。

1.4.5 細胞AKT信號通路相關因子檢測 取1.4.1中兩組轉染24 h細胞，參照1.3的方法檢測AKT信號通路相關因子p-AKT、Bcl-xl蛋白相對表達量，p-AKT、Bcl-xl稀釋倍數均為1∶1 000。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 隨著培養時間的延長，兩組細胞增殖能力均呈上升趨勢。細胞培養2～5天沉默組OD490值均低于對照組(P均<0.05)。兩組培養5天細胞增殖能力比較見表1。

表1 兩組細胞增殖能力比較

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.2 兩組細胞凋亡率比較 沉默組與對照組細胞凋亡率分別為(4.09±0.24)%、(1.31±0.19)%，兩組比較P<0.05。

2.3 兩組細胞穿膜細胞數比較 沉默組與對照組穿膜細胞數分別為(51.07±1.36)、(95.65±2.31)個，兩組比較P<0.05。

2.4 兩組細胞p-AKT、Bcl-xl蛋白相對表達量比較 沉默組p-AKT、Bcl-xl蛋白相對表達量均低于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組細胞p-AKT、Bcl-xl蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

脊椎動物Eya家族包含四種轉錄激活因子，即Eya1、Eya2、Eya3、Eya4，該家族基因在進化上比較保守[4,8,9]。Eya基因編碼產生的蛋白質在多種生物的胚胎發育過程中發揮重要作用，還具有調控細胞周期轉化、誘導細胞凋亡等作用[6,10]。Eya基因發生突變或者表達異?？梢詫е律矬w多種器官發育異常、遺傳性疾病及惡性腫瘤的發生。研究發現，在乳腺癌細胞中，Eya2表達上調，應用基因干擾技術敲除Eya2后乳腺癌細胞增殖、侵襲均受到抑制，細胞凋亡水平顯著升高[11]。在肺癌細胞中，miR-30以Eya2為直接作用靶基因，通過下調腫瘤細胞Eya2表達水平抑制肺癌發展[7]。在人卵巢癌細胞中，Eya2表達上調，并且與患者不良預后及較低的生存率有關[12]。在感染人乳頭狀瘤病毒的宮頸角質細胞中，敲除Eya2基因后細胞的活力、細胞的增殖能力及轉移能力都受到不同程度的抑制[13]。

細胞通過復雜的細胞周期調控系統控制細胞分裂過程，從而維持正常細胞增殖過程和機體代謝。細胞周期的調控是由一系列重要的信號分子和周期蛋白家族來完成的，當相關基因發生突變或者表達水平發生變化時，將導致細胞周期調控的改變，細胞增殖能力增強、分化能力減弱，喪失細胞原有生理功能，最終發展成為腫瘤細胞[14,15]。Eya在許多腫瘤中出現高表達，并調節腫瘤細胞增殖[16]、血管形成、侵襲遷移以及凋亡等過程[16～18]。本研究結果顯示，前列腺癌細胞PC-3、DU145、LNCAP中Eya2蛋白相對表達量均高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1，說明前列腺癌細胞中Eya2蛋白相對表達量明顯升高，Eya2蛋白表達升高可能參與了前列腺癌的發生過程。

細胞的增殖和凋亡處于動態平衡是機體維持正常運轉的前提，當這種動態平衡被打破，細胞增殖過度、凋亡不足均會導致組織細胞發生惡變[19]。惡性腫瘤最重要的生物學特性是其具有局部浸潤和遠處轉移的能力，呈浸潤性生長的腫瘤不僅可以在原發部位繼續生長，更重要的是其能夠向周圍組織和細胞直接蔓延，還可以通過多種途徑擴散至身體的其他部位[20,21]。因此，腫瘤細胞的侵襲能力對腫瘤的惡性蔓延至關重要。本研究結果顯示，細胞培養2～5天沉默組細胞增殖能力均低于對照組，細胞凋亡率高于對照組，穿膜細胞數低于對照組；說明沉默Eya2基因可降低前列腺癌細胞增殖、侵襲能力，提高其凋亡能力，有助于抑制前列腺癌的惡性進展。

AKT信號通路在廣泛的人類腫瘤譜中失調，該通路異常活化可影響腫瘤細胞的多種惡性生物學行為，包括細胞增殖、分化、凋亡等。非磷酸化的AKT蛋白不具備生物學活性，當其經過PI3K/AKT信號通路的磷酸化作用轉變為p-AKT時可以被激活，進而通過不同的機制促進細胞的增殖、分化等。Bcl-xl是Bcl-2家族蛋白的一員，也是AKT信號通路下游的靶向蛋白。Bcl-xl在機體中發揮抗凋亡蛋白的作用。本研究結果顯示，沉默組p-AKT、Bcl-xl蛋白相對表達量均低于對照組，說明沉默Eya2基因后前列腺癌細胞AKT信號通路活性受到抑制，其下游抗凋亡靶蛋白Bcl-xl表達下調，因此細胞增殖受到抑制、凋亡水平有所提升。

綜上所述，沉默Eya2基因可降低前列腺癌PC-3細胞的增殖、侵襲能力，提高細胞凋亡能力；抑制AKT信號通路可能是其作用機制。提示Eya2可能作為診斷和治療前列腺癌的一個重要靶基因。