酪酸梭菌對阿司匹林致大鼠小腸黏膜損傷的影響及機制

徐林芳，安敏，沈曼茹，黃繼英，唐鄂，崔英，顏美珠，李曉翠，倪倩雯，高振軍

(復旦大學附屬中山醫院青浦分院，上海201700)

阿司匹林是最常用的非甾體類抗炎藥(NSAIDs)之一，作為抗血小板聚集，防止血栓形成的一線藥物被廣泛應用于臨床。NSAIDs最主要的副作用是消化系統不良反應，如胃黏膜炎癥及潰瘍等。近年來，NSAIDs所致腸道損傷越來越受到關注。有研究認為，NSAIDs相關性腸黏膜損傷比NSAIDs相關性胃黏膜損傷更為常見，可引起小腸出血、蛋白丟失性腸病、回腸吸收功能障礙、腸通透性升高及結腸出血、穿孔等[1～4]。酪酸梭菌是醫用功能益生菌，是腸道內一類產酪酸的益生菌，其產生的酪酸是維持腸黏膜能量代謝、組織再生修復和腸道免疫平衡的重要物質，可以調節腸道菌群平衡，抑制腸道不良微生物生長，且對致病微生物具有拮抗作用[5]。目前關于酪酸梭菌對NSAIDs致胃腸黏膜損傷的作用鮮見報道。為此，我們于2013年5月～2015年4月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質量180～220 g，購自上海市第九人民醫院動物實驗室(動物許可證號：SCXK[滬]2012-0017)。阿司匹林腸溶片(100 mg/粒，Bayer)；酪酸梭菌活菌(米桑)重慶泰平藥業有限公司(200 mg/粒)，含酪酸梭菌活菌數不低于2×107CFU/g。

1.2 大鼠分組及處理 將SD大鼠室溫條件下常規飼養，隨機分為對照組、模型1組、模型2組、干預1組、干預2組，每組12只。后四組均制備阿司匹林腸黏膜損傷模型。具體方法：依據成人有效治療劑量及人與動物藥物劑量換算公式計算出大鼠所需阿司匹林劑量。對照組給予生理鹽水2 mL灌胃14天；模型1組給予阿司匹林50 mg/kg(用生理鹽水稀釋至2 mL)灌胃14天；模型2組給予阿司匹林50 mg/kg(用生理鹽水稀釋至2 mL)灌胃7天，等量生理鹽水灌胃7天；干預1組同時給予阿司匹林50 mg/kg及酪酸梭菌4 mg灌胃14天；干預2組給予阿司匹林50 mg/kg灌胃7天，再給予酪酸梭菌4 mg灌胃7天。各組大鼠均于給藥14天結束時眼眶靜脈取血后處死，取中段小腸40 cm。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 一般情況 各組大鼠均每日測量體質量，進行大便常規檢查，并觀察大鼠一般狀態。

1.3.2 血清TNF-α、IL-1檢測 采用ELISA法。取各組眼眶靜脈血，離心后留取血清，檢測TNF-α、IL-1，具體方法參照試劑盒(北京柏萊斯特科技發展有限公司)說明書。

1.3.3 小腸黏膜大體形態及組織病理學評分 取小腸組織1 cm常規石蠟包埋、切片，HE染色，對小腸黏膜大體形態損傷及組織學損傷進行評分。腸黏膜大體形態評分標準：0分：無損傷；1分：局部充血、水腫，未出現潰瘍；2分：有潰瘍，不伴黏膜明顯充血、水腫等炎性表現；3分：有潰瘍，伴一處黏膜炎癥；4分：有多處潰瘍和炎癥，潰瘍≤1 cm；5分：有多處潰瘍和炎癥，至少1處潰瘍>1 cm。腸黏膜組織病理學按Chiuetal 氏法評分：0分：腸黏膜絨毛正常；1分：腸黏膜絨毛頂端上皮出現囊狀間隙，伴有毛細血管充血；2分：腸黏膜上皮下間隙擴大，固有層中度水腫，中央乳糜管擴張；3分：腸黏膜固有層明顯水腫，黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數絨毛頂端脫落；4分：腸黏膜上皮細胞層變性、壞死、脫落，部分絨毛脫落、固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5分：腸黏膜絨毛脫落，固有層崩解、出血或潰瘍形成。每個樣本隨機計數10個視野，對每個視野按標準進行單獨評分，取平均數為最終病理評分。

1.3.4 小腸組織髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及NO水平檢測 將其余小腸組織放入5 mL燒杯內，用勻漿器制成10%組織勻漿，采用ELISA法檢測MPO、SOD、NO，具體方法參照試劑盒(北京柏萊斯特科技發展有限公司)說明書。

2 結果

2.1 各組一般情況比較 造模過程中各組大鼠均無死亡。對照組一般情況良好；其余四組喂食阿司匹林后出現不同程度體質量下降、活動減少、少食，造模1周后均出現大便隱血陽性，模型1、2組上述改變的程度重于干預1組、2組。見表1。

表1 各組造模前后體質量及大便隱血結果

2.2 各組血清TNF-α、IL-1水平比較 見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-1水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型1組比較，△P<0.05；與模型2組比較，#P<0.05。

2.3 各組小腸黏膜大體形態及組織病理學評分比較 小腸黏膜大體形態：對照組大鼠小腸黏膜無肉眼可見損傷；其余各組小腸黏膜損傷程度輕重不一，多表現為黏膜局部充血水腫，部分出現腸壁散發糜爛、潰瘍及增厚。小腸黏膜組織病理學變化：對照組大鼠小腸黏膜組織形態正常，絨毛完整無脫落；其余各組小腸黏膜組織結構異常，絨毛中心分離壞死、脫落，固有層崩解，出血伴潰瘍形成，黏膜下可見大量中性粒細胞浸潤，間質有充血、水腫。模型1、2組及干預1、2組大鼠小腸黏膜大體形態及組織病理學評分均高于對照組，且模型1、2組均高于干預1、2組，組間比較P均<0.05。見表3。

表3 各組小腸黏膜大體形態及組織病理學評分比較(分，

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型1組比較，△P<0.05；與模型2組比較，#P<0.05。

2.4 各組小腸組織勻漿MPO、SOD及NO水平比較 見表4。

表4 各組小腸組織勻漿MPO、SOD及NO水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型1組比較，△P<0.05；與模型2組比較，#P<0.05。

3 討論

NSAIDs通過抑制花生四烯酸的環氧合酶(COX)途徑，減少前列腺素(PGs)和白三烯的合成，進而發揮解熱、鎮痛、抗炎、抗風濕和抗血小板聚集等作用。然而COX有兩種亞型，即COX1和COX2，COX2是導致炎癥反應的酶，而COX1是具有生理作用的結構酶。NSAIDs在抑制COX2發揮解熱鎮痛作用的同時，也導致生理性COX1合成減少，引發患者出現多種不良反應，涉及胃腸道、心血管、腎臟、肝臟、神經系統等[6～8]。其中以胃腸道刺激和組織損傷尤為常見，輕者表現為黏膜充血、水腫、糜爛及一過性淺表潰瘍，重者可造成多發潰瘍合并消化道出血、穿孔，甚至危及生命。由于NSAIDs本身的鎮痛作用，其所致的腸道損傷多表現為“無痛性”，即使已存在潰瘍、出血，患者也無任何主觀感受，延誤疾病治療。本研究采用NSAIDs藥物的代表阿司匹林誘導大鼠出現腸黏膜損傷，結果顯示阿司匹林處理大鼠小腸黏膜均出現損傷，多表現為黏膜局部充血水腫，部分出現腸壁散發糜爛、潰瘍及腸壁增厚；組織病理學上表現為小腸黏膜組織結構異常，絨毛中心分離壞死、脫落，固有層崩解，出血伴潰瘍形成，黏膜下可見大量中性粒細胞浸潤，間質有充血、水腫。進一步證實了阿司匹林對腸道黏膜的損傷作用。

酪酸梭菌能促進雙歧桿菌等反映機體體內定植力的腸道有益菌生長，提高機體的定植耐性，抑制G-桿菌等腸道有害菌生長，恢復腸道菌群平衡，改善腸道微生態[8,9]。酪酸梭菌產生的酸性物質可降低腸道局部pH值，通過抑制G-桿菌等優勢移位菌的過度增殖，減少腸道內毒素的產生和吸收，阻斷腸道菌群移位，改善腸道菌群失調，減輕腸黏膜損傷，促進腸黏膜的免疫功能及生理功能恢復[10～13]。給予阿司匹林致胃潰瘍小鼠酪酸梭菌預處理，結果顯示酪酸梭菌可通過抗氧化應激、增加胃黏液量，上調Bc1-2/Bax，減輕阿司匹林造成的胃潰瘍損傷[14,15]。

MPO是中性粒細胞活化的標志物，其產生的氧自由基參與組織損傷及機體的炎癥反應；SOD是生物體內清除自由基的首要物質，其濃度越高，提示組織的氧化損傷越大。NO、TNF-α、IL-1作為促炎細胞因子，由血管內皮細胞合成和釋放，可以激活炎癥反應[16，17]。本研究結果顯示，與對照組比較，其余四組腸黏膜組織MPO、NO及血清TNF-α、IL-1水平均升高，且模型1、2組均高于干預1、2組；SOD水平均降低，模型1、2組均低于干預1、2組。提示阿司匹林可導致大鼠小腸黏膜氧化應激及炎癥損傷，酪酸梭菌可減少氧自由基、NO及促炎癥因子TNF-α、IL-1的過度產生，進而抑制氧化應激反應及炎癥反應對腸道黏膜的損傷。本研究設置的模型1組各項指標變化均高于模型2組，提示阿司匹林致小腸黏膜損傷有一定的時間依賴性；兩組間各指標比較差異均無統計學意義，可能與造模動物數量相對少，觀察時間點未進一步細分有關。酪酸梭菌干預1、2組上述指標比較差異均無統計學意義，提示酪酸梭菌均可發揮抑制腸道黏膜損傷的作用，但干預時間對結果影響不大。上述結果還需擴大樣本量、細化酪酸梭菌干預濃度后進一步驗證。

綜上所述，酪酸梭菌可用于治療阿司匹林所致的腸道黏膜損傷，抑制氧化應激反應及炎癥反應可能是其作用機制。