逆轉素對肝星狀細胞炎癥反應的影響及機制

麥振豪，黃迪,2，翁杰鋒,2，黃子圣，黃宇，張漢意，張帥,2，古維立,2

(1 廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院，廣州510180；2華南理工大學第二附屬醫院)

肝纖維化是多種病因導致的一種慢性肝臟病理改變，炎癥反應可促進肝纖維化的發生發展[1]。研究發現，肝星狀細胞激活導致肝內細胞外基質沉積增加是肝纖維化發生的主要原因，而肝臟炎癥的存在可以直接或間接刺激星狀細胞活化，促進肝纖維化形成[2]。多種細胞因子如IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、轉錄生長因子β(TGF-β)等均可誘導HSC活化[3]。逆轉素(Reversine)是一種人工合成的小分子嘌呤衍生物，可使已分化的細胞重新具有多向分化的潛能[4]。本課題組前期研究證實，Reversine能促進HSC凋亡，并可抑制星狀細胞中TGF-β1通路的激活[5]，但Reversine與肝臟炎癥反應的關系尚未明確。2017年5～7月，本研究觀察了Reversine干預對星狀細胞TNF-α、核轉錄因子κB p65(RELA)、IL-6、IL-17A mRNA表達的影響。現分析結果，探討Reversine在肝纖維化炎癥反應過程中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝星狀細胞購自廣州中山大學細胞庫；Reversine購自Sigma Aldrich公司； Recombinant Human TNF-α購自PeproTech公司；重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白(rhTNFR，TNF-α抑制劑)購自三生國健藥業(上海)股份有限公司。

1.2 細胞培養及分組處理 將肝星狀細胞接種于含有100 mL/L FBS的DMEM培養基的35 mm培養皿內；置于5% CO2、37 ℃培養箱內進行傳代培養。細胞生長至80%左右融合時進行傳代并隨機分為五組。對照組常規培養，低濃度Reversine組加入終濃度為5 μg/mL的Reversine培養，高濃度Reversine組加入終濃度為10 μg/mL的Reversine培養，TNF-α組加入終濃度為0.05 μg/mL的TNF-α培養，rhTNFR組加入終濃度為10 μg/mL的Reversine及終濃度為0.5 mg/mL的rhTNFR培養。各組均培養24 h。

1.3 細胞形態觀察 各組于藥物干預后在Olympus IX51倒置顯微鏡下觀察細胞形態改變。

1.4 細胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。采用TRIzol法分別提取各組細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將總RNA轉錄為 cDNA，引物設計與合成均由廣州市銳博生物科技有限公司完成。在PCR儀上進行實時定量PCR，測定靶基因的表達量。檢測條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，61 ℃、30 s，70 ℃、30 s，40個循環。反應結束后，對所有樣品進行規一化處理，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GAPDH作為內參基因。

2 結果

2.1 各組細胞形態變化 對照組細胞生長狀態良好，貼壁牢，細胞間連接緊密，胞體呈梭形或形態不規則，具有樹突狀突起，邊界清，大小均勻；Reversine組細胞間連接減少，出現皺縮、變圓、脫落，形成扁而大的細胞結構，上述細胞形態改變在高濃度Reversine組更明顯；TNF-α組細胞亦出現皺縮、變圓等類似高濃度Reversine組的形態改變；rhTNFR組上述細胞形態改變程度小于Reversine組及TNF-α組。

2.2 各組細胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA表達比較 見表1。

表1 各組細胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低濃度Reversine組比較，△P<0.05；與高濃度Reversine組比較，#P<0.05；與TNF-α組比較，▲P<0.05。

3 討論

正常肝臟在一些致病因子的長期作用下會出現炎癥反應，使肝細胞死亡，而肝細胞死亡又可以加重炎癥反應程度，兩者相互作用共同促進纖維化的發生。當致病因子消除或者人為干預后，肝纖維化可得到逆轉，逆轉的關鍵靶細胞是星狀細胞[6]。Reversine是一種小分子藥物，其分子結構式為C21H27N7O。Reversine可使定向細胞系去分化為未分化的具有多種潛能的干細胞，這些干細胞經誘導后可再次分化為不同種類細胞。Shan等[7]發現Reversine可通過抑制肌源性轉錄蛋白desmin和myogenin表達進而抑制星狀細胞生長，還可促進Ezh2和PHC1蛋白表達使細胞重新編程。

TNF-α是目前公認的強大的促炎癥細胞因子，主要由單核細胞譜系的細胞如巨噬細胞、星形膠質細胞等產生，通過介導1型和2型TNF受體發揮促炎作用，在多種慢性炎癥疾病的發病中發揮關鍵作用[8]。有研究表明，TNF-α可通過c-Jun途徑誘導促纖維化因子的表達，且可激活Kupffer細胞進而促進星狀細胞活化，刺激星狀細胞合成膠原，誘導纖維化形成；還可增強TGF-β對星狀細胞的增殖和刺激膠原合成的作用[9]。本研究結果顯示，Reversine組、TNF-α組、rhTNFR組干預后細胞形態均發生炎性改變，且高濃度Reversine組、TNF-α組更顯著，提示Reversine可導致星狀細胞發生炎癥反應。

IL-6是一種主要由活化的單核細胞產生的多功能細胞因子，是肝臟炎癥和急性反應階段的重要炎癥介質，可直接通過MAPK或JAK/STAT信號通路激活肝星狀細胞[10]。Gajalakshmi等[11]發現，鼠肝臟來源的BMOL細胞分泌的IL-6可以通過NF-κB-iNOS-NO-ROS信號通路使活化的星狀細胞凋亡，有潛在的預防肝纖維化發生的功能。亦有研究報道，IL-6雖然是重要的促炎因子，但在正常生理條件下是必不可少的，其通過選擇性地介導信號通路抑制多種慢性肝臟病變的發生[12]。提示IL-6在肝纖維化炎癥過程中發揮雙重作用。

IL-17A的作用主要是介導炎癥反應過程，亦可刺激α-SMA、TGF-β、TNF-α等表達，特別是對TGF-β/SMAD信號通路，IL-17A可上調TGF-β-RⅡ進而促進星狀細胞活化，還可通過激活STAT3途徑促進星狀細胞形成Ⅰ型膠原，促進肝纖維形成[13,14]。Pu等[15]報道，IL-17A可激活ROS/p38通路進而促進內皮細胞組織因子表達，參與肝纖維化的炎癥過程；IL-17A缺乏的肝纖維化小鼠其炎癥及纖維化程度均減輕；提示IL-17A在促炎和促纖維化方面均發揮重要作用[16]。

RELA是Rel/NF-κB轉錄因子家族最常見的細胞轉錄因子，被認為是誘導促炎癥基因表達的重要轉錄因子。RELA廣泛存在于各種細胞中，可被各種刺激激活，與免疫應激、細胞增殖與凋亡、炎癥反應等關系密切[17]。RELA不但可調節肝細胞、星狀細胞等多種細胞的基本功能，也是炎癥過程中各種炎性基因的關鍵調節因子，其激活可同時促進多種細胞因子如IL-1β、TGF-β1、TNF-α等表達。此外有研究發現，敲除RELA后星狀細胞凋亡增加，Ⅰ型膠原形成減少，說明RELA可促進肝纖維化的發生發展[18]。

本研究結果顯示，肝星狀細胞經高濃度Reversine處理后TNF-α mRNA表達減少、 IL-6 mRNA表達增加；Reversine抑制TNF-α表達的效果弱于rhTNFR，提示Reversine可能不是通過TNF-α途徑發揮作用，其可能通過作用于IL-6發揮作用。TNF-α明顯刺激IL-17A mRNA表達，高濃度Reversine處理后IL-17A mRNA表達明顯受到抑制，且其抑制效果比rhTNFR更強。Reversine抑制IL-17A表達的能力強于rhTNFR。Reversine有可能通過抑制星狀細胞 IL-17A表達發揮抗炎、抗纖維化作用。本研究中各Reversine干預組RELA mRNA表達無明顯變化，提示Reversine對RELA的調節作用不明顯。IL-6表達增加可通過NF-κB-iNOS-NO-ROS通路促進星狀細胞凋亡。但本研究各組干預前后RELA表達無明顯變化，說明Reversine不能刺激NF-κB表達，其通過IL-6途徑促進星狀細胞凋亡的可能性不大，但由于IL-6是炎癥反應中的關鍵因子，所以Reversine更有可能是通過直接促進IL-6表達進而參與調節其他炎癥因子的表達而發揮作用，但其具體機制仍需進一步探討。Reversine抑制IL-17A的表達，可能是通過抑制肝星狀細胞激活發揮作用，還可進一步抑制α-SMA、TGF-β等促纖維化蛋白表達，使膠原纖維沉積減少。

綜上所述，Reversine可抑制肝星狀細胞的炎癥反應；抑制IL-17A表達、促進IL-6表達可能是其作用機制。