泡沫細胞DNA甲基化及其對脂代謝基因SREBP1表達的影響

李顯東，陳平英，謝華強，彭春艷，張吉才

(湖北醫藥學院附屬醫院 十堰市太和醫院，湖北十堰442000)

冠心病是一種發生在大、中型動脈的慢性疾病，動脈粥樣硬化(AS)是其發生的病理基礎。外周循環中血脂增加可導致膽固醇在動脈血管的血管壁沉積，T細胞和單核-巨噬細胞浸潤局部血管壁，二者吞噬氧化的脂質顆粒并在內皮下形成泡沫細胞，導致動脈平滑肌細胞增生、細胞外基質成分聚集，形成粥樣斑塊，誘發血管阻塞、心肌梗死、下肢缺血性壞死、動脈瘤和腦梗死等[1～5]。DNA甲基化是一種發生在DNA序列上的甲基化修飾，主要指在DNA甲基轉移酶(DNMT)的作用下，基因組DNA胞嘧啶第五位碳原子共價結合一個甲基基團被修飾為5-甲基胞嘧啶(5-mC)的反應。研究顯示，表觀遺傳方式DNA甲基化參與了動脈粥樣斑塊的形成和發展[6]。2015年7月～2017年7月，本研究采用單核細胞系THP-1構建泡沫細胞即AS粥樣斑塊形成的體外模型，檢測泡沫細胞DNMT的表達變化，探討脂質代謝障礙的表觀遺傳學機制，以期為AS的預防和治療提供理論依據。

1 材料

單核細胞系THP-1購于武漢大學動物實驗中心；含DNA甲基轉移酶1(DNMT1)全長的質粒由武漢大學生命科學院朱應教授惠贈；培養基、FBS購自Gibco公司；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒及總RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；引物合成及測序由武漢擎科生物有限公司完成；PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自Takara公司；Lipofectamine2000購于Invitrogen公司；聚偏氟烯(PVDF)膜購自Fugene公司；ECL發光底物購自Millipore公司；膽固醇調節元件結合蛋白1(SREBP1)、GAPDH抗體購于Abcam公司；乙酸酯(PMA)購于Sigma公司；LDL購于武漢艾美捷公司。將LDL置于20 μmol/L的CuSO4溶液中，37 ℃震蕩水浴15 h，濾膜過濾，制備氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，置于- 20 ℃冰箱保存備用。

2 方法與結果

2.1 泡沫細胞模型建立 將THP-1細胞懸浮于含10% FBS、1%雙抗的DMEM 1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養，加入終濃度為10 nmol/L的PMA培養48 h，觀察細胞貼壁情況，確定THP-1細胞已分化為巨噬細胞(在40×10倍顯微鏡下觀察，見細胞呈梭形貼壁生長，并伸出偽足)；用不含血清的培養基饑餓處理24 h；加入含150 nmol/L ox-LDL的DMEM 1640培養基培養48 h；觀察泡沫細胞形成(在40×10倍顯微鏡下觀察細胞形態，見細胞為橢圓或不規則形狀，大小不一，核偏居細胞一側，符合泡沫細胞形態特征)；油紅“O”染色鑒定脂質吞噬情況(在40×10倍顯微鏡下觀察，可見大量紅色脂質顆粒環行分布在細胞內壁)，收集細胞。根據細胞形態學改變，初步證實培養細胞為泡沫細胞。

2.2 THP-1單核細胞和泡沫細胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達 采用實時熒光定量PCR法。分別取THP-1單核細胞及2.1制備的THP-1泡沫細胞，采用Qiagen試劑盒提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度。取1 μg總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板采用SYBR Green進行實時定量熒光PCR反應。引物序列：DNMT1引物上游：5′-ACCGCTTCTACTTCCTCGAGGCCTA-3′，下游：5′-GTTGCAGTCCTCTGTGAACACTGTGG-3′；DNMT3A引物上游：5′-GACAAGAATGCCACCAAAGC-3′，下游：5′-CGTCTCCGAACCACATGAC-3′；DNMT3-B引物上游：5′-CCAGCTGAAGCCCATGTT-3′，下游：5′-ATTTGTCTTGAGGCGCTTG-3′；內參GAPDH引物上游：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算各因子相對表達量。結果顯示，在THP-1泡沫細胞中DNMT1相對表達量低于THP-1單核細胞(P<0.05)，兩種細胞中DNMT3A、DNMT3B相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。后續研究選擇DNMT1基因進行轉染。

表1 THP-1單核細胞和泡沫細胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達比較

注：與THP-1單核細胞比較，*P<0.05。

2.3 細胞分組及轉染 將2.1中獲取的泡沫細胞接種于6孔板(1×106個/孔)，隨機分為對照組、空載體組、DNMT1組，對照組常規培養，空載體組轉染空載對照質粒，DNMT1組轉染DNMT1質粒。轉染方法：將轉染培養基、質粒、Lipofectamine2000等自冰箱取出，復蘇至室溫；稀釋4.0 μg質粒DNA至250 μL OPTI培養基中混勻，稀釋10 μL脂質體至250 μL OPTI培養基中混勻，均靜置5 min；上述配置液體混合25 min，均勻加入無抗生素培養基的細胞孔中；培養6 h吸出轉染液，PBS輕柔吹吸1遍，更換為DMEM 1640完全培養液。收集三組細胞，采用Western blotting法檢測DNMT1蛋白表達。DNMT1一抗工作液濃度為1 μg/mL；采用ECL發光試劑盒檢測蛋白表達量。結果顯示，對照組、空載體組、DNMT1組DNMT1 蛋白表達量分別為0.017 2±0.006 8、0.016 9±0.007 9、0.035 7±0.009 5，DNMT1組較其他兩組表達量升高，說明轉染成功。

2.4 SREBP1啟動子甲基化檢測 采用華大基因MassArray甲基化檢測方法檢測SREBP1基因啟動子CpG島29個CG位點的甲基化改變情況。將三組細胞DNA中沒有甲基化的C全部轉化為U(相當于DNA中的T)，使用特殊設計的一對引物擴增樣本，得到帶有T7 RNA聚合酶啟動子序列的擴增產物。在體外轉錄體系中，利用T7 RNA聚合酶將擴增產物轉錄為RNA片段。利用RNase A能夠特異性識別并切割RNA中U3′端的特性，將RNA片段切割成攜帶有CpG位點的小片段。在相同的片段中，使用MassArray飛行質譜分析系統檢測產物。結果顯示，與對照組、空載體組比較，DNMT1組SREBP1基因啟動子區CpG島22號 CG位點啟動子發生高甲基化，而其他28個CG位點的未發生甲基化。

注：A為SREBP1基因啟動子部分序列(共499 bp)，CG為CpG島可檢出CG位點，CG為因序列原因無法檢出的CG位點。B中圓點代表檢測序列中的CpG位點。C為THP-1泡沫細胞轉染DNMT1質粒后SREBP-1啟動子甲基化變化情況。

圖1質譜法檢測SREBP1基因啟動子區域甲基化水平所包含序列及位點信息

2.5 SREBP1 mRNA和SREBP1蛋白表達 ① SREBP1 mRNA表達：采用實時熒光定量PCR法，具體方法參照2.2。SREBP1引物上游： 5′-ACGGCAG-CCCCTGTAACGACCACTGTGA-3′，下游5′-TGCCAA-GATGGTTCCGCCACTCACCAGG-3′。② SREBP1蛋白表達：采用Western blotting法，具體方法參照2.3。結果顯示，DNMT1組SREBP1 mRNA和蛋白相對表達量均較其他兩組降低(P均<0.05)。見表2。

表2 三組SREBP1 mRNA和蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與空載體組比較，△P<0.05。

3 討論

DNA甲基化是一種發生在DNA序列上的甲基化修飾，由DNMT催化。在DNMT家族中，DNMT1的功能主要是在DNA復制和修復中維持子代鏈與親代鏈一致的甲基化模式。本研究構建了THP-1單核細胞泡沫化模型，發現在THP-1泡沫化之后DNMT1表達顯著降低，提示冠心病發病機制中甲基化模式可能受到異常的DNMT1表達調控。既往在冠心病患者外周血白細胞、ApoE敲除小鼠主動脈、人進展期粥樣斑塊中均觀察到基因組DNA總體甲基化水平降低的現象[7,8]，在AS斑塊區的特定基因如超氧化物歧化酶基因低甲基化可能與DNMT的表達變化相關[9]。DNMT3的主要功能是使未甲基化的CpG位點發生新甲基化，即參與DNA的從頭甲基化，包括兩個從頭甲基轉移酶DNMT3A、DNMT3B和一個調節蛋白DNMT3L。與普通飲食的野生型小鼠相比，高脂飲食的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠肝臟組織中DNMT3A及DNMT3B表達均顯著升高，提示異常的DNA重新甲基化調控可能在肝臟脂質代謝的過程中發揮重要作用。本研究THP-1泡沫細胞和單核細胞中DNMT3A及DNMT3B表達比較差異無統計學意義，提示泡沫細胞的形成可能與DNMT3A及DNMT3B無關。

目前對于單個基因啟動子甲基化與冠心病的關聯分析是冠心病發病機制的研究熱點[10]。Afzali等[11]通過病例對照研究發現，膽固醇代謝基因NPC1基因啟動子甲基化可抑制NPC1表達，促進冠心病的發生、發展；Jiang等[12]報道，脂蛋白相關磷脂酶(PLA2G7)基因啟動子甲基化與冠心病的發病顯著相關；Friso等[13]發現，F7啟動子異常高甲基化與更高的FⅦa血漿濃度和冠心病危險有關。由此提示，異常的甲基化模式操控脂代謝基因的表達，從而影響脂質代謝，可能是冠心病的發病機制之一。

脂質代謝紊亂是冠心病的發病基礎，過剩的脂質沉積在動脈內膜是動脈粥樣斑塊形成的始動因素。SREBP1屬于堿性螺旋-環螺旋-亮氨酸拉鏈(bHLH-zip)轉錄因子家族，可調節編碼脂質生物合成酶的基因表達，促進肝膽固醇和脂肪酸的生物合成[14]。SREBP1在細胞內膽固醇代謝的轉錄調節中發揮重要作用。當細胞的膽固醇水平改變時，SREBP1裂解釋放形成轉錄因子，并與其他脂代謝基因結合，組成脂代謝調控網絡調控脂質代謝[15]。SREBP1表達失衡可引起血脂代謝紊亂，導致脂肪組織在動脈壁的過度蓄積，可誘發冠心病[16]。本研究觀察到，THP-1細胞泡沫化后DNMT1表達下調，推測這一變化可能會對細胞特定基因的甲基化修飾模式產生影響；進一步將泡沫細胞轉染DNMT1，檢測細胞脂代謝相關基因啟動子甲基化狀態的變化發現，SREBP1基因啟動子CpG島特異CG位點發生甲基化，且該基因mRNA及蛋白表達水平均顯著下降，提示脂代謝障礙可能與脂代謝基因的甲基化紊亂有關。

綜上所述，冠心病發病機制中的泡沫細胞形成可能受到DNA甲基化的調控，但DNA甲基化參與心血管疾病發生發展的具體機制尚不清楚，在未來研究中需要更多直接的證據論證。