噬菌體展示技術篩選胃癌高表達CD44分子特異性多肽序列的可行性分析

林小波，賈環，于照祥，李四光，李貞，常偉平

(西安醫學院第一附屬醫院，西安710077)

CD44是一種細胞膜整合糖蛋白，在很多腫瘤組織及細胞中表達上調，在胃癌細胞中CD44表達明顯高于正常細胞[1,2]，可能作為胃癌的生物標記分子[3,4]。噬菌體展示技術是一種簡便、有效、快速、廉價的獲得分子多肽受體配體的技術[5,6]。多肽分子經標記后成為一類分子探針，可應用于分子成像技術，對腫瘤進行早期診斷及治療效果評價[7,8]。2016年2月～2017年12月，我們通過噬菌體展示技術針對胃癌高表達的CD44分子進行親和力篩選，旨在獲得胃癌靶向性多肽探針，以期為胃癌的早期診斷提供方法。

1 材料

人胚腎細胞株HEK293(本校實驗室提供、貯存)。噬菌體展示肽庫：噬菌體展示隨機十二肽文庫，購自New England Biolabs(美國)，標識滴度為1.5×1013pfu/mL，總量100 μL，貯存于含50%甘油的TBS緩沖液中。宿主菌：E.coliER2738購自New England Biolabs(美國)，以含50%甘油的菌體培養物形式貯存于- 80 ℃冰箱。M13噬菌體-96gⅢ引物：引物序列為5′-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′，購自New England Biolabs(美國)。胎牛血清蛋白(BSA)購自Amresco公司(美國)。

2 方法與結果

2.1 噬菌體展示隨機十二肽文庫滴度測定 使用噬菌體展示隨機十二肽文庫，稀釋度為1×10-8的培養板噬菌斑數量約為120個，根據噬菌體滴度=(噬菌斑數目×稀釋倍數)pfu/10 μL，計算噬菌體展示隨機十二肽文庫的滴度約為1.2×1011pfu/10 μL。

2.2 以CD44純化蛋白為靶點篩選親和力多肽 將CD44純化蛋白固定固相表面(酶標板)作為靶點，利用噬菌體展示隨機十二肽文庫首先與包被有BSA的陰性孔結合，吸走上清后，上清再與包被有CD44純化蛋白的陽性孔結合，做消減篩選，以盡量去除隨機多肽庫中能與BSA結合的克隆，減少非特異性吸附，增加篩選的特異性和親和力。根據2.1得到的滴度，每輪篩選投入病毒子數量必須穩定在1.0×1011，因此首輪投入噬菌體10 μL，每輪篩選后滴定洗脫物滴度，擴增洗脫物后滴定擴增物滴度，并計算每輪產出/投入比，以觀察每輪篩選的富集，作為篩選是否成功的一個參考參數(正常情況下，一個成功的篩選會出現優勢克隆的富集)。4輪篩選的投入、產出、產出/投入情況見表1。第1、2、3、4輪富集倍數分別為1倍、1.45、11.4、896倍。

表1 四輪篩選的投入、產出、產出/投入

2.3 從最終洗脫庫中挑選克隆并測序 經過四輪親和力篩選，最終從第4輪的洗脫物中，通過涂板挑單克隆的方法隨機挑選出30個噬菌體單克隆(P1～P30)。隨后對這些克隆進行擴增并提取單鏈DNA模板，將模板樣本及測序引物進行全自動測序(蘇州金唯治生物科技有限公司)。根據噬菌體展示隨機十二肽文庫試劑盒附帶使用手冊讀序圖，使用Bioedit查看測序圖譜，尋找隨機肽編碼DNA序列插入點兩端限制性內切酶KpnⅠ酶切位點GGTACC和EgalⅠ酶切位點CGGCCG，十二肽序列編碼DNA序列插入上述兩個酶切位點之間，讀取插入序列后，利用DNAStar軟件將插入序列的堿基序列翻譯為氨基酸序列。

結果顯示，噬菌體克隆P1、P2、P5、P8、P9、P12、P14、P18、P20、P23、P27、P28具有相同序列，測序并手工翻譯多肽序列為Trp His Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Thr Gln Gln Ala(簡寫為WHXXXXXXQQA)；噬菌體克隆P4、P7、P10、P16、P19、P21、P26、P30具有相同序列，測序并手工翻譯多肽序列為Thr Leu Trp His Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Met Arg(簡寫為TLWHXXXXXXMR)；噬菌體克隆P6、P11具有相同序列，測序并手工翻譯多肽序列為Trp His Asn Ser Tyr Trp Tyr Trp Pro Val Met Arg(簡寫為WHNSYWYWPVMR)；噬菌體克隆P22序列，測序并手工翻譯多肽序列為Ser Tyr His Thr His Pro His Ala Gly Pro Pro Phe(簡寫為SYHTHPHAGPPF)；噬菌體克隆P3、P13、P24具有相同序列，測序并手工翻譯多肽序列為Glu Tyr Ser Pro Val Tyr Ala Pro Thr His Gln Gly(簡寫為EYSPVYAPTHQG)；噬菌體克隆P25序列，測序并手工翻譯多肽序列為His Trp Ser Trp Trp Tyr Thr Phe Asn His Thr Pro(簡寫為HWSWWYTFNHTP)；噬菌體克隆P15、P17、P29具有相同序列，測序并手工翻譯多肽序列為Asn Asn His Ala Gly Gln Lle Met Val His Lys Tyr(簡寫為NNHAGQIMVHKY)。

綜合30個噬菌體克隆的測序結果，可以獲得7條多肽序列，分別為S1(WHXXXXWTQQA)、S2(TLWHXXXXPAMR)、S3(WHNSYWYWPVMR)、S4(SYHTHPHAGPPF)、S5(EYSPVYAPTHQG)、S6(HWSWWYTFNHTP)、S7(NNHAGQIMVHKY)。其中S1重復12次，S2重復8次，S5、S7重復3次，S3重復2次，S4、S6出現1次。通過ClustalX軟件和人工均可發現S1和S2之間同源性較高，S1和S2存在共有6肽基序(Motif)WHXXXX(其中X表示該位氨基酸保密，X位氨基酸可變，經分析在S1和S2中該位均為親水性氨基酸)。見表2。

2.4 多肽序列噬菌體克隆與CD44的親和力檢測 采用ELISA法。對上述7個多肽序列的代表噬菌體克隆，在ELISA板上設陽性孔3個，包被CD44純化蛋白，陰性孔3個，包被BSA，并用野生型作為對照，以檢測各個噬菌體克隆對BSA包被酶標板的結合情況，并排除假陽性克隆。以陽性OD490/陰性OD490>2.5作為判斷陽性克隆的標準，最終挑選出S1、S2、S5、S7四個陽性克隆，其陽性OD490/陰性OD490分別為6.61、3.36、3.24、3.10，其中S1初步鑒定為親和力最高的克隆。見表3。

表2 多肽序列及基序

2.5 陽性噬菌體克隆的靶向性檢測 采用免疫熒光法。通過GV146-CD44質粒轉染HEK1293細胞獲得膜表達的CD44，以GV146空質粒轉染的HEK293細胞作為陰性對照，最終確定S1-WHXXXXXXQQA對CD44的親和力和特異性最好。

表3 多肽序噬菌體克隆對CD44的親和力

3 討論

噬菌體展示隨機多肽庫是一種快速簡便的篩選分子親和短肽配體的方法，其篩選出的短肽對靶分子具有良好的親和力和特異性[9]。多肽探針可人工合成，具有相對分子質量小、穩定性佳、活性好、生物穿透力強、親和力與特異性高、免疫原性低、毒性低等優點[10,11]。本研究結合腫瘤的分子生物學特征和影像學進展，旨在通過噬菌體展示技術針對胃癌高表達的CD44分子進行親和力篩選，以獲得胃癌靶向性多肽探針[12]，利用該分子探針進行分子影像學成像，有望提高傳統影像學手段對早期胃癌的檢出率[13,14]。

首先，我們使用噬菌體十二肽庫以CD44純化蛋白為靶點進行四輪親和力篩選，對每輪篩選的洗脫物進行滴度測定。結果顯示，隨著篩選輪次的遞增，富集倍數亦遞增。經過四輪篩選，從最終洗脫物中我們隨機挑選30個克隆進行測序，這些噬菌體克隆共有7個展示多肽序列，其中序列S1、S2分別重復出現12次和8次，并且兩者擁有共同六肽基序WHXXXX(其中X氨基酸可變，而可變位經分析均為親水性氨基酸)，因此基序WHXXXX出現頻率達20/30。隨后，我們對這些序列進行生物信息學分析，發現基序WHXXXX與已知蛋白kiSS-1 receptor有較高同源性[15]。我們進一步利用GV146-CD44質粒轉染HEK293細胞使其高表達CD44，以其為靶點利用噬菌體隨機肽庫進行篩選。CD44分子通過質粒轉染細胞，這種結合類似于抗原、抗體結合。此時CD44分子處于膜整合狀態，其結構與在正常及腫瘤細胞中表達的CD44完全相同，是適合篩選的最理想狀態[16,17]。但這種方法仍然存在缺陷，因為細胞膜雖然保持了蛋白質的天然結構，但細胞膜上的其他成分也同時干擾了篩選的特異性[18]。從研究結果來看，固相篩選雖然簡單并可能影響蛋白分子的天然結構，但在一些情況下與細胞篩選相比并不一定處于劣勢。另外，國外亦有研究者嘗試通過將蛋白分子體外表達到一種納米級磷脂雙分子層上以結合固相篩選法和細胞篩選法各自的優勢，亦取得較好的篩選效果[19]。因此，為了獲得更具實用價值、親和力及特異性更好的靶向短肽，需要更多的具有創新性的篩選方法。

對S1與S2擁有的共同序列WHXXXX通過軟件與CD44透明質酸結合域進行分子對接中發現[20]，該基序確實能與CD44成功對接，在空間結構及自由能方面具有良好的結合特性，說明S1可能主要通過序列WHXXXX與CD44發生作用。經過四輪篩選，共獲得短肽序列7個，后續ELISA法證實了序列S1對CD44具有高親和力。但是，以純化蛋白為靶點的ELISA法檢驗的是噬菌體與固相固定分子的親和力，而當蛋白質固定于固相表面時，往往會發生空間構型等改變，并且ELISA法較易受到多種因素的干擾。因此，我們又通過細胞免疫熒光法進一步檢驗陽性噬菌體克隆是否能與膜整合狀態的CD44分子相互作用表現出良好的親和力和特異性。結果再次證實S1-WHXXXXXXQQA對CD44的親和力和特異性最好。

綜上所述，通過噬菌體展示技術篩選S1-WHXXXXXXQQA對CD44的親和力和特異性最好；其有望成為一個特異性探針，用于胃癌的分子影像學診斷。