反相液相色譜法對米糠油中四種生育酚含量的測定

李晴 周曉晴 陳沙 喻俊磊

摘要：建立了反相液相色譜法同時測定植物油中4種生育酚的方法。樣品用甲醇超聲提取，離心后取上清液氮吹至干，甲醇定容后過有機(jī)相濾膜，PEF柱（150 mm×3.0 mm，2.6 μm）分離，甲醇∶水（88∶12）作流動相等度洗脫，流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；熒光檢測（λex=294 nm，λem=328 nm）進(jìn)樣5 μL，外標(biāo)法定量，在20 min內(nèi)同時分離出α-、β-、γ-和δ- 4種生育酚異構(gòu)體。4種生育酚的質(zhì)量濃度在0.5～50.0 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999。在3個添加水平下的平均加標(biāo)回收率在84.47%～116.50%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤6.0%（n=6），α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚及δ-生育酚的方法檢出限分別為0.10、0.05、0.05、0.04 mg/kg，表明該方法靈敏度高，回收率好，可應(yīng)用于實際樣品的分析。

關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜；熒光檢測；生育酚；米糠油

中圖分類號：O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0087-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.021

Abstract： The method of simultaneous determination of 4 kinds of tocopherol in vegetable oil was established by reversed-phase liquid chromatography.After sample ultrasonic extraction with methanol，centrifugal supernatant liquid nitrogen blow to dry，the capacity after the methanol organic phase filter membrane，PEF column（150×3.0 mm，2.6microns） separation，methanol and water （88∶12） elution flow equal degree，velocity 0.4 mL/min；Column temperature 30 ℃；The fluorescence detection （a） of the sample volume was 5 μL，the external standard method was quantitatively determined，and the two types of paroxygenol isomers were isolated at the same time in 20 min. The mass concentration of 4 kinds of tocopherol was in a good linear relationship with the peak area within the range of 0.5～50.0 μg/mL，and the linear correlation coefficient was greater than 0.999. Adding in the three levels with respect to the average recovery was 84.47%～116.50%，relative standard deviation（RSD） for 6.0% or less（n=6），alpha tocopherol，beta tocopherol，gamma tocopherol and delta-tocopherol，method detection limit （LOD） were respectively 0.10，0.05，0.05，0.04 mg/kg. The method is accurate，sensitive and reliable，and can be applied to the analysis of actual samples.

Key words： inverse phase high performance liquid chromatography； fluorescence detection； tocopherol； rice bran oil

生育酚（Tocopherol）俗稱維生素E，是人體代謝所必需的一種植物源性脂溶維生素，室溫下為油狀液體，橙黃或淡黃色，在熱、酸等環(huán)境比較穩(wěn)定，遇堿不穩(wěn)定，易氧化。根據(jù)甲基的數(shù)目和位置的不同分為α-、β-、γ-和δ- 4種不同形式（結(jié)構(gòu)式見圖1）。4種生育酚的生物活性強(qiáng)度不同，如α-生育酚分布最廣、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最強(qiáng)。生育酚對人體有重要的生理功能，具有抗氧化、抗衰老、抗不育、調(diào)節(jié)免疫力等作用，對生殖功能、細(xì)胞代謝均有影響[1]，對一些臨床疾病有積極的預(yù)防作用。植物油中含有豐富的生育酚[2-5]，但不同植物油中生育酚的種類和含量有所不同。橄欖油、葵花子油、葡萄子油主要含有α-生育酚，核桃油、菜子油、亞麻子油、玉米油、大豆油中主要為γ-生育酚，另外大豆油中含有相對較高的δ-生育酚，米糠油含有最齊全的4種維生素E組分[6，7]。在發(fā)達(dá)國家，米糠油是一種與橄欖油齊名的健康營養(yǎng)油，深受高血脂、心腦血管疾患人群喜愛，并早已成為西方家庭的日常健康食用油，隨著中國稻米精深加工業(yè)整體水平的提高，以及人們對油類產(chǎn)品的營養(yǎng)保健作用的重視，米糠油的產(chǎn)業(yè)鏈正在逐步形成，其市場潛力將逐步釋放，由于米糠油本身穩(wěn)定性良好，適合作為煎炸用油，還可制作人造奶油、起酥油以及高級營養(yǎng)油等。選用米糠油作為研究對象，并對生育酚在煎炸過程中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

目前食品中生育酚測定常用的檢測方法有分光光度法、高效液相色譜法（Highperformance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜法（Gas chromatography，GC）及傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)TIR）等。其中，應(yīng)用最廣泛的為高效液相色譜法，包括正相液相色譜法[8-10]和反相液相色譜法[11-15]。新國標(biāo)GB 5009.82-2016[16]與GB/T26635-2011[17]均采用正相色譜法測定α-、β-、γ-及δ-生育酚，但是正相高效液相色譜法有許多缺點，如流動相揮發(fā)性強(qiáng)、一些溶劑強(qiáng)致癌性、重復(fù)性差、分析時間長及穩(wěn)定性差等，加之正相液相色譜在應(yīng)用上不如反相色譜廣泛。故有必要建立一種反相液相色譜的分析方法用于4種生育酚檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

米糠油（市售）。

1.2 試劑

生育酚標(biāo)準(zhǔn)品：α-生育酚（純度99.9%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；β-生育酚（純度95.2%，BePure）；γ-生育酚（純度94.6%，BePure）；δ-生育酚（純度95.2%，SUPELCO）。

甲醇、正己烷（SCHARLAB S.L公司）均為色譜純；試驗用水為超純水。

1.3 儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)（美國戴安公司）；離心機(jī)（德國Sarorius公司）；恒溫氮吹儀（江西華科精密儀器有限公司）；振蕩器（上海愛朗儀器有限公司）；超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（精度為0.000 1 g，德國Sarorius公司）。

1.4 方法

1.4.1 生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液 準(zhǔn)確稱取生育酚標(biāo)準(zhǔn)品50 mg于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液溶解后，定容至刻度，得到1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃避光保存，臨用前校正。

1.4.2 生育酚標(biāo)準(zhǔn)工作液 分別移取不同體積中間工作液到50 mL棕色容量瓶，用乙醇定容至刻度，稀釋配制濃度為0.500、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用前校正。

1.4.3 樣品前處理 稱取0.50 g植物油樣于50 mL離心管中，加入10.00 mL甲醇，振蕩提取10 min，以4 000 r/min離心5 min，取5.00 mL液體，避光氮吹干，用1.00 mL甲醇定容，過0.25 μm有機(jī)相濾膜，待測。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別將“1.4.2”中系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按試驗方法進(jìn)樣，記錄得到的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 色譜條件

PEF色譜柱（150 mm×3.0 mm×2.6 μm），柱溫為室溫，甲醇-水（88∶12）作流動相等度洗脫，流速0.4 mL/min，熒光檢測（激發(fā)波長為294 nm、發(fā)射波長為328 nm）進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化 采用正相液相色譜法測定食品中的生育酚，前處理簡單但是進(jìn)樣過程繁瑣、耗時長且重復(fù)性較差，本方法采用甲醇和乙腈進(jìn)行反相液相色譜法提取和分析，結(jié)果顯示用甲醇做為溶劑進(jìn)行提取時提取率較高且樣品圖譜無干擾性雜峰（圖2）。為了獲得更好的提取率，對甲醇的提取體積進(jìn)行考察，其回收率見圖3。其中用10 mL甲醇作為萃取溶劑時，萃取率最高。因此，選擇10 mL的甲醇做溶劑。

2.1.2 檢測器的選擇 對比熒光檢測器與紫外檢測器對生育酚的靈敏度（圖4），結(jié)果表明熒光檢測器對生育酚的靈敏度更強(qiáng)。

2.2 線性關(guān)系考察

2.2.1 生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 將α-、β-、γ-及δ-生育酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚在0.1～50.0 μg/mL，α-生育酚在0.5～50.0 μg/mL具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗 對同一樣品進(jìn)行6次重復(fù)進(jìn)樣，δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和α-生育酚相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表2。

2.2.3 回收率試驗 對米糠油樣品進(jìn)行3個添加水平的加標(biāo)，按照“1.4.3”中的方法處理后進(jìn)高效液相色譜儀，高、中、低回收率見表3。4種生育酚的加標(biāo)回收率在84.47%～116.50%，表明該方法回收率良好，結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3 樣品穩(wěn)定性測試

對不同煎炸時間米糠油的含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。由表4可以看出，煎炸米糠油中各種生育酚含量隨煎炸時間的延長而降低，至煎炸32 h，生育酚含量基本喪失，僅存微量的α-生育酚。

3 結(jié)論

本研究建立了反相高效液相色譜法同時測定米糠油中4種生育酚的分析方法，該方法操作簡單、線性良好、穩(wěn)定性好及回收率滿足分析要求且該方法中4種生育酚的檢出限及定量限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.82-2016規(guī)定的檢出限要求，既節(jié)約了成本又節(jié)省了時間，因此該方法可用于實際樣品的檢測。

隨著油炸時間延長，4種生育酚的活性明顯降低，而地溝油是由植物油經(jīng)高溫煎炸反復(fù)使用后得到，因此可將生育酚含量作為地溝油篩選的指標(biāo)之一。

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