阿莫西林在農桿菌介導甘藍型油菜遺傳轉化中的使用和優化

石文慧，安 然，郭海霞，張金文，，王朋寶，曹 智，王志偉，喬 巖

(1.甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州 730070； 2.甘肅省干旱生境作物學重點試驗室，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點試驗室，甘肅蘭州 730070)

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)是重要的油料作物，30多年來油菜轉基因研究得到了迅速發展，以轉基因技術為核心的生物技術被譽為第二次“綠色革命”。陳錦清等育成的高含油量轉基因油菜超油1號、超油2號新品系是目前世界上含油量最高的甘藍型油菜[1]。何業華等將Bt基因導入甘藍型油菜湘油13號，現已獲得遺傳穩定的抗蟲油菜新品系[2]。但轉化過程中，植物組織與攜帶目的基因的根癌農桿菌共培養后，往往難以抑制和脫除農桿菌，使得外植體成活率下降，愈傷誘導率和芽再生率降低，轉化效率偏低，從而限制轉基因技術的廣泛利用，影響油菜育種水平的提高和新基因的功能分析鑒定。因此，為實現高效的遺傳轉化，有必要找到一種高效抗生素，在有效脫除農桿菌的同時，減少對愈傷誘導和芽再生的抑制作用，對于甘藍型油菜遺傳轉化具有重要的應用價值。

農桿菌介導法已成為油菜等蕓薹屬植物基因轉化中最常用的方法。目前為止，已先后在甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜等作物上實現了報告基因、抗除草劑基因、抗病蟲基因、雄性不育基因、改良油菜成分和蛋白組分基因等的遺傳轉化。2004年山西農業大學利用花粉介導法將GUS基因轉入油菜，其轉化頻率高達2.8%，逐步建立甘藍型冬油菜花粉介導轉化的新體系[3]。盧愛蘭等將蕪菁花葉病毒基因導入油菜，獲得對油菜黃化花葉病毒(TuMV)抗性[4]。2014年徐茜育成了具有抗草甘膦基因的甘藍型油菜新品種浙大619[5]。石東喬等將反義油酸脫飽和酶基因(Fad2基因)導入油菜，獲得了高油酸含量，低亞油酸、亞麻酸的轉基因油菜[6]。長期以來，農桿菌介導的遺傳轉化采用的抑菌劑多為羧芐青霉素和頭孢霉素，因為它們可以抑制原核生物細胞壁的生成，進而抑制細菌。關于羧芐青霉素(carbenecillin)和頭孢霉素(cefotaxime)對油菜轉化的研究已有報道[7]，裴冬麗等在白菜型油菜的轉化中發現這2種抗生素對農桿菌菌株LBA4404有很強的抑制作用[8]。高武軍等研究發現500 mg/L的羧芐青霉素可以完全抑制農桿菌的生長[9]。Han等在小麥的遺傳轉化中發現頭孢霉素在250 mg/L可以完全抑制農桿菌生長[10]。在高梁遺傳轉化中發現250～500 mg/L的羧芐青霉素可以有效抑制農桿菌[11]。但是，以上研究并沒有分析頭孢霉素和羧芐青霉素對植物再生潛力的影響。有研究認為頭孢霉素可能會抑制芽的分化[12-14]，而羧芐青霉素則抑制根的形成[15]。此外，抗生素的濃度對遺傳轉化也有一定的影響。如濃度為250 mg/L的頭孢霉素不利于玉米愈傷組織的形成[16]，并最終導致轉化效率反而低于100 mg/L的處理；羧芐青霉素在隨后的試驗中都采用100 mg/L來抑制農桿菌[17]。特美汀(timentin)和阿莫西林(amoxicillin)是應用于農桿菌介導的植物遺傳轉化中的新型抗菌素，特別是在胚性愈傷組織再生系統中具有很好地抑菌效果，而且對組織再生的抑制較小。Costa等在農桿菌介導煙草的轉化中發現特美汀具有較高的轉化頻率并對根的生長具有促進作用[18]。胡威研究柑橘時發現特美汀降低了芽的再生頻率，導致70%的再生芽產生突變，而在阿莫西林的培養基中是正常的[19]。阿莫西林是一種無菌單獨包裝、穩定且便于攜帶的抗生素，其價格相對于羧芐青霉素、頭孢霉素、特美汀便宜。2014年Naing等首次研究了阿莫西林對“鮮紅”菊花[Chrysanthemummorifolium(Ramat)]葉片外植體培養的植株再生能力的影響，發現250 mg/L的阿莫西林不但可以抑制農桿菌菌株LBA4404，而且對外植體具有高效的轉化頻率，證明了阿莫西林可有效取代羧芐青霉素或頭孢霉素[20]。但阿莫西林應用于農桿菌介導的甘藍型油菜遺傳轉化中并未見報道。

因此，本研究在油菜種質遺傳轉化過程中，設置4種不同濃度的抗生素，以確定適合于甘藍型油菜農桿菌介導的抗生素種類和濃度，并明確阿莫西林在甘藍型油菜遺傳轉化中的效果，這對于提高農桿菌介導的油菜遺傳轉化效率、加快油菜種質資源創新具有重要的理論價值和應用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與藥品

以甘藍型油菜雜交種青雜5號的恢復系“1831R”為試驗材料。農桿菌菌株選用LBA4404、GV3101。植物表達載體為pCAMBIA1300(圖1)，該載體使用草甘膦抗性基因EPSPS(5-enolpyruvy lshikmate-3-phosphate synthase，5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)替換了pcAMBIA1300的潮霉素抗性標記Hyp(圖1)。羧芐青霉素(Carb)、頭孢霉素(Cef)、特美汀(Tim)、阿莫西林(Amo)、Kan、Rif、AgNO3、AS、6-BA、2，4-D、NAA、草甘膦均用0.22 μm的濾膜抽濾。

1.2 方法

1.2.1 外植體的制備 外植體制備參照鄒智等的研究方法[21]。選取籽粒飽滿的種子，70%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次；1%的次氯酸鈉溶液(0.3 g+30 mL H2O2)浸泡 13～15 min(期間不時搖動)，無菌水沖洗3～5次；接種于萌發培養基上，每瓶約20粒種子，置培養箱培養誘導萌發，培養條件如下：溫度(25±3)℃下，光照16 h/d，光強2 000 lx萌發。4～5 d后切取其下胚軸，轉接于預培培養基。

1.2.2 含表達載體pCAMBIA1300的農桿菌菌株LBA4404、 GV3101的活化 參照王關林等所述的方法[22]。(1)取出含表達載體pCAMBIA1300的農桿菌菌株LBA4404劃線接種于含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP固體培養基平板上，28 ℃ 下倒置黑暗培養2～3 d。(2)于轉化前1 d挑取單菌落，接種于20 mL含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP液體培養基中，置于搖床上28 ℃下200～210 r/min培養過夜(16 h 左右)，使菌體達到對數期(D600 nm=0.6～0.8)。(3)取400 μL菌液轉接入20 mL無抗生素的YEP液體培養基中，繼續培養4～6 h。(4)將菌液倒入無菌帶蓋的50 mL離心管內，蓋上管蓋，用封口膜封口，4 000 r/min離心5 min。(5)取出離心管，在超凈工作臺上棄去上清，向離心管內加入適量MS液體培養基，懸浮起菌體，28 ℃下210 r/min離心，使其吸光度達到0.4～0.6 之間，即可用作接種外植體的工程菌液。農桿菌GV3101的活化等同。

1.2.3 外植體的農桿菌侵染 將預培2～3 d的下胚軸置于無菌的小培養皿中，向皿中倒入制備好的工程菌液，中間輕緩晃動數次，3～5 min后倒掉菌液，然后將下胚軸投入無菌水中清洗3遍，置于無菌濾紙上，吸干表面液滴，隨即轉移到共培養培養基(不含抗生素和草甘膦)中，25 ℃下黑暗培養2 d。

1.2.4 4種抗生素對抑制2種土壤根癌農桿菌菌株的作用 試驗設計2個處理，即將500 mg/L 4種抗生素(Carb、Cef、Tim、Amo)分別加入2種土壤根癌農桿菌菌株的YEP培養基(分別挑取農桿菌菌株LBA4404、GV3101的單菌落于25 mL含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP液體培養基中)，置于搖床上28 ℃下200～210 r/min培養過夜(16 h左右)，2種土壤根癌農桿菌菌株的YEP培養基不加任何抗生素設為對照，然后分別測其吸光度。

1.2.5 抗生素濃度設計和抑菌效果鑒定 試驗設計4個處理，每個處理設6個濃度梯度，即100、200、300、400、500、600 mg/L，每個處理設置3次重復。將農桿菌菌株LBA4404侵染后共培養2 d的外植體轉入抑菌培養基。培養基經高壓滅菌后，按試驗設計分別添加不同濃度的抗生素，于植物培養箱中培養，培養條件為28 ℃、16 h/8 h光周期、光照度 2 000 lx。在培養3 d后連續觀察抑菌情況。抑菌完全的標準為外植體在與培養基接觸的部位未出現農桿菌菌落。抑菌率=未孳生農桿菌的外植體數/農桿菌侵染后的總外植體數×100%。

1.2.6 抗生素對芽再生的影響鑒定 在抑菌7 d之后，采用楊長友等報道的愈傷誘導培養基(MS培養基，含4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3，NAA、AgNO3、滅菌后另加)[23]，培養基經高壓滅菌后，按“1.2.5”節設計的抗生素濃度梯度，分別添加，同時設置對照試驗，即外植體(未經農桿菌侵染)在愈傷誘導過程中不加抗生素，28 ℃、16 h/8 h 光周期、光照度2 000 lx培養20 d后連續觀察愈傷誘導情況。采用王俊生等報道的愈傷分化培養基(MS培養基，含2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，NAA滅菌后另加)[24]。培養基經高壓滅菌后，按“1.2.5”節設計的抗生素濃度梯度，分別添加，同時設置對照試驗，即外植體(未經農桿菌侵染)愈傷分化過程中不加抗生素，培養條件為28 ℃、16 h/8 h光周期、光照度2 000 lx，培養15 d后觀察芽再生情況。芽再生率=帶芽外植體數/總外植體數×100%

1.2.7 草甘膦抗性篩選及PCR檢測 試驗設計4個處理，即依據“1.2.6”節試驗結果分別在芽再生培養基加入4種抗生素各自相對應的最適濃度，每個處理設置3次重復。同時加入抗性篩選試劑草甘膦(Gly)，濃度為8 mg/L。芽再生培養基為MS培養基，含4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+8 mg/L Gly，NAA、抗生素滅菌后另加。15 d后統計擬轉基因植株，并進行PCR驗證，統計轉化率。轉化率=轉基因植株總數/總外植體數×100%。

用CTAB法提取擬轉基因植株和對照(未轉化植株)的基因組DNA，用于PCR擴增。

EPSPS基因的PCR引物為5′-TCTACAAATCTATCTC-TCTCG-3′、5′-GGAACTACTCACACATTATTA-3′。

產物長度為1 350 bp，建立25 μL反應體系：ddH2O(17.5 μL)、10×PCR Buffer(2.5 μL)、dNTP Mixture(2.0 μL)、上游引物(0.75 μL)、下游引物(0.75 μL)、TaKaRaTaq(0.5 μL)。PCR反應條件為95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52.9 ℃ 30 s，72 ℃ 81 s，30個循環；72 ℃ 8 min。反應結束后，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2003和SPSS 19.0進行處理。

2 結果與分析

2.1 4種抗生素對抑制根癌農桿菌的效果

500 mg/L的4種抗生素對抑制根癌農桿菌菌株(LBA4404、GV3101)的效果如圖2所示。結果顯示，加入羧芐青霉素(Carb)、頭孢霉素(Cef)、特美汀(Tim)、阿莫西林(Amo)的液體YEP培養基吸光度都為0。在對照試驗中，吸光度在正常值(0.6～0.8)之間。說明濃度為500 mg/L的4種抗生素均有抑制農桿菌菌株LBA4404、GV3101繁殖和生長的效果，可以用于后續試驗。

2.2 4種不同濃度抗生素在MS固體培養基上的抑菌效果

如圖3所示，4種抗生素濃度在500～600 mg/L對抑菌率的影響差異不顯著，而在100～400 mg/L對抑菌率的影響差異顯著。其中，100 mg/L時，Carb比Cef、Tim、Amo抑菌率高151.11%、303.57%、32.94%，Amo比Cef、Tim抑菌率高88.89%、203.57%；200 mg/L時，Carb比Cef、Tim抑菌率高37.65%、105.26%，Amo比Cef、Tim抑菌率高88.89%、203.57%；300 mg/L時，Carb比Tim抑菌率高50.63%，Amo比Tim抑菌率高49.37%；400 mg/L時，Carb比Tim抑菌率高10.78%，Amo比Tim抑菌率高8.01%。表明較高濃度(500～600 mg/L)抗生素處理下，4種抗生素都可以很好地抑制農桿菌的生長。同時，濃度低于500 mg/L時，Carb抑菌效果最好，其次是Amo，再次是Cef、Tim。

以Amo為例，共培養7 d后發現，當濃度在400～600 mg/L 時，其抑菌效果如圖4-a、圖4-b、圖4-c所示，接種下胚軸的培養基中未見農桿菌孳生；當濃度為300 mg/L時，培養基中雖未見農桿菌孳生，但下胚軸少許脫水且與培養基接觸的部位呈水漬狀，褐化較嚴重，活性降低，如圖4-d；當濃度為100～200 mg/L時，下胚軸基部出現大量農桿菌菌落，菌落數與抗生素濃度呈反比。

2.3 4種不同濃度的抗生素對芽生長的影響

4種不同濃度的抗生素對芽生長的影響不同(圖5)。從總體趨勢來看，隨著4種抗生素濃度的增加，芽再生率呈先增加后降低趨勢，其中濃度在300 mg/L時達到最大；且在相同濃度下，經Amo處理的芽再生率最高，其次為Carb、Tim、Cef。當Amo濃度在100～200 mg/L時，比相同濃度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高3.62%、13.86%、14.05%；當Amo濃度在300 mg/L時，比相同濃度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高 1.86%、9.76%、9.76%；當Amo濃度在400～600 mg/L時，比相同濃度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高1.29%、9.53%、8.98%。由以上結果可知，4種抗生素中阿莫西林濃度在300 mg/L 時最適于芽再生。

以Amo為例，其不同濃度對愈傷誘導芽再生的影響不同，Amo濃度在300～600 mg/L下時，可以發現隨著濃度的增加，經愈傷誘導芽再生的數量在明顯下降，當濃度增加至600 mg/L時，愈傷組織停止生長而且生長出毛根，這表明高濃度的抗生素可抑制愈傷組織芽的再生。圖6中e～h是第35天時4種抗生素濃度在300 mg/L時對愈傷誘導芽再生的生長狀況。經Amo處理的芽的生長要優于Cef、Tim，而與Carb處理的芽的生長狀況差異不大；經Cef處理的愈傷組織分化的再生芽呈現玻璃化現象；經Tim處理的愈傷組織出現綠點，但并未分化出芽。

2.4 草甘膦抗性篩選及PCR檢測

500個總外植體，經草甘膦抗性篩選，轉化過程使用Carb的擬轉化植株18株；使用Cef的擬轉化植株13株；使用Tim的擬轉化植株8株；使用Amo的擬轉化植株25株。提取擬轉化植株的DNA，以質粒pCAMBIA1300為陽性對照，以未轉化植株為陰性對照，進行PCR擴增(圖7)，統計轉化效率(圖8)。

試驗發現使用Carb的擬轉化植株18株中經PCR擴增得到6株與預期長度一樣的擴增產物，轉化效率為1.2%；使用Cef的擬轉化植株13株中經PCR擴增得到3株與預期長度一樣的擴增產物，轉化效率為1.0%；使用Tim的擬轉化植株8株中經PCR擴增未得到與預期長度一樣的擴增產物；使用Amo的擬轉化植株25株經PCR擴增得到10株與預期長度一樣的擴增產物，轉化效率為1.9%。Amo比Carb、Cef轉化效率分別高58.33%、90.00%。而陰性對照未擴增到相應的片段。初步證明EPSPS基因已成功導入到甘藍型油菜恢復系中，且說明轉化過程適用Amo的轉化效率是最高的。

3 討論與結論

本研究表明，在甘藍型油菜雜交種青雜5號的恢復系“1831R”的遺傳轉化過程中，采用新型的抗生素制劑，包括了農桿菌介導的植物轉化中常用的抗生素[羧芐青霉素(Carb)、頭孢霉素(Cef)]和尚未廣泛應用的新型抗生素[阿莫西林(Amo)、特美汀(Tim)]，以轉化再生植株表現為依據，研究4種抗生素對農桿菌的脫除效果以及對油菜再生植株轉化率的影響，發現轉化初期，較高濃度(500～600 mg/L)抗生素處理下，4種抗生素都可以很好地抑制農桿菌的生長，濃度低于500 mg/L時，Carb抑菌效果最好，其次是Amo，再次是Cef、Tim。周小梅等在研究9種抗生素的抑制效果時發現Carb在500 mg/L、Cef在600 mg/L時對農桿菌菌株LBA4404、EHA105可以達到很好的抑菌效果[7]，本研究結果與之類似。Gould等在松樹遺傳轉化中也得到類似的研究結果[25]。Naing等在菊花的研究中發現，Amo在250 mg/L可以完全抑制農桿菌菌株LBA4404的生長[20]。黃昌蓉在研究甘藍型油菜早熟基因遺傳轉化體系的建立時發現，分化培養階段500 mg/L的Tim難以控制農桿菌的生長，會導致外植體全部褐化，然后死亡[26]，但本研究發現，Tim在400 mg/L時可以達到很好的抑菌效果，這可能與農桿菌侵染的菌液濃度和時間有關，而本研究與Cheng等研究煙草遺傳轉化中的結果[27]類似。

抗生素不僅對農桿菌有抑制作用，而且對芽再生也有一定的影響。適宜的抑菌劑既要對農桿菌具有良好的抑制作用，又不能對外植體生長產生較大影響[28]。在芽再生階段，隨著4種抗生素濃度的增加，芽再生率呈先增加后降低趨勢，其中濃度在300 mg/L時達到最大。且在相同濃度下，經Amo處理的芽再生率最高，其次為Carb、Tim、Cef。Naing研究發現Carb和Amo對芽再生的影響比Cef小，本試驗結果與之一致。Ren在研究柑橘的遺傳轉化中發現經阿莫西林處理的愈傷組織誘導芽再生的頻率優于特美汀處理[19]，本研究結果與之一致。Cef和Tim在不同濃度下誘導愈傷組織產生再生芽數量低于Carb，這與前人在疫苗、結球甘藍、玉米中的研究結果[15-19]類似。經草甘膦抗性篩選及PCR檢測，轉化體系中使用Amo的轉化效率比Carb、Cef轉化效率分別高58.33%、90.00%。

綜上，阿莫西林是甘藍型油菜雜交種青雜5號的恢復系“1831R”遺傳轉化中最適的抗生素。羧芐青霉素、頭孢霉素、阿莫西林、特美汀對后續再生芽生根能力是否有影響，以及殘留的抗生素是否會影響轉化植株移栽至大田后的生長，有待進一步研究。