閩西地區仔豬病毒性腹瀉流行情況調查

董 波，張寄香，戴愛玲，李曉華，李靜楠，楊小燕

(1.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖 364012； 2.福建省生豬疫病防控工程技術研究中心，福建龍巖 364012；3.湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙 410128)

豬病毒性腹瀉病是由1種或多種病毒單獨或混合感染各年齡段豬所引發的伴有腹瀉、嘔吐和脫水等典型癥狀的消化道機能紊亂疾病[1]。豬病毒性腹瀉病主要表現為病豬體溫正常或稍高、精神沉郁、食欲減退或廢絕，常常導致豬群生長發育遲緩，死亡率升高，給養豬業造成重大經濟損失，嚴重阻礙畜牧行業發展。因此，了解仔豬病毒性腹瀉病的流行局勢，有助于更有效的施行防治措施。

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus，RV)是引起豬病毒性腹瀉的3種主要病原，均具有較強的傳染性，哺乳仔豬的易感性最強，致死率高[2]。3種病毒皆為接觸性傳播，在致病性和流行病學上極為相似，皆以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，臨床上不易分辨。

近年來，PEDV在我國多個省(市、區)的發病率呈上升趨勢，是困擾養豬業的主要疾病之一。2011年張世忠等對福建省各個地區的規模化養豬的頑固性腹瀉病例進行檢測，PEDV感染率高達52.2%[3]。然而，部分病例存在2種或3種病毒混合感染的情況，對養豬業的潛在危害不容忽視。因此，本研究將2014年1月至2016年12月期間送至龍巖學院動物醫學研究所的135例疑似患有病毒性腹瀉仔豬的組織樣品采用RT-PCR進行診斷，分析閩西地區豬病毒性腹瀉的流行狀況，以期為病毒性腹瀉的防控提供資料依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

收集2014年1月至2016年12月福建龍巖及周邊地區規模化養豬場送往龍巖學院動物醫學研究所進行診斷，患有腹瀉的仔豬腸道組織及內容物，共計135份。

1.2 主要試劑

DL 2000 Marker、總RNA提取液(TaKaRa RNAiso Reagent)、病毒RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa miniBEST Viral DNA/RNA extraction Kit Ver.3.0)、AMV反轉錄酶、rTaqDNA聚合酶、Oligo(dT)、dNTP、DNA Marker DL 2000、RNA酶抑制劑、pMD19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒(DNA Gel extraction Kit)及質粒提取試劑盒(Plasmid Miniprep Kit)購自愛思進生物技術有限公司產品；感受態細胞制備試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；三氯甲烷、異丙醇采用分析純試劑。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank上發表的PEDV、TGEV、RV基因序列，使用Premier Premier 5.0生物軟件設計合成特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物詳情見表1。

表1 引物序列

1.4 一步法RT-PCR

按照病毒RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)提供的操作手冊，自小腸組織及內容物中提取總RNA并作為模板，進行PCR擴增。PCR反應程序：45 ℃作用30 min，94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35 次；72 ℃延伸10 min。產物經電泳分離，在凝膠成像系統下記錄結果。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

產物經凝膠電泳鑒定，結果獲得與預期大小相同的片段(圖1)。將純化后的PCR產物連接到pMD19-T載體，轉化入DH5α感受態細胞，涂板過夜，挑取單個菌落，提取質粒，將陽性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，序列結果正確。

2.2 PEDV、TGEV和RV的感染情況統計

對PEDV、TGEV和RV的感染情況進行統計顯示，PEDV的檢出率最高，達到30.37%，而TGEV和RV的檢出率分別為13.33%和11.11%(表2)。

表2 PEDV、TGEV和RV的感染情況

2.3 PEDV、TGEV和RV感染的季節性分布

3種病毒全年均被檢出，PEDV和RV在冬季感染率較高，陽性檢出率分別達到45.95%和16.22%，TGEV在春季的感染率相對其他季節較高，其陽性檢出率為17.65%(表3)。

表3 各季節仔豬腹瀉病毒陽性檢出率統計結果

2.4 PEDV、TGEV和RV年份分布

對各年份陽性檢出率進行統計，結果顯示，PEDV的陽性檢出率在2015—2016年間有所下降，仔豬流行性腹瀉病的流行有所減緩；TGEV陽性檢出率從2014—2015年期間有明顯下降，至2016年又出現小幅提升；RV的陽性檢出率變化不明顯，波動平緩(表4)。

表4 各年份陽性檢出率統計

3 討論與結論

本研究自2014年1月至2016年12月對閩西地區部分規模化豬場中疑似患有病毒性腹瀉疾病的樣品進行診斷，數據統計得出，閩西地區PEDV、TGEV、RV的陽性檢出率依次為30.37%、13.33%和11.11%；PEDV和RV混合感染、TGEV和RV混合感染、PEDV和TGEV混合感染和3種病毒均被感染的陽性檢出率分別為3.70%、2.22%、0.74%和 0.74%，與我國其他地區檢出率相近[4-5]。已有報道指出，在2012—2013年期間，閩西地區PEDV、TGEV、RV的陽性檢出率分別為22.9%、25.0%、14.6%[6]。對比本研究統計數據發現，TGEV和RV的陽性檢出率有所降低，PEDV的感染率有一定升高，3種病毒混合感染的比例有所降低。同時，相比全國近年來豬感染腹瀉病毒的流行情況，閩西地區的TGEV、RV的陽性率均處于較低水平，而PEDV的陽性率仍然高于部分省(市、區)，應當加強防控[7-8]。

本研究中3種腹瀉病毒在1年中均被檢出，其中PEDV在冬季檢出率最高，為45.95%。春、夏和秋季的檢出率分別為26.47%、20.00%、2.00%，冬、春2季PEDV的檢出率明顯高于夏、秋2季，這一結果與PEDV在寒冷季節尤其在冬春季多發的流行特點相吻合，與我國部分地區的檢出情況相似，說明寒冷季節有利于PEDV的感染與傳播[9]。RV在春、夏、秋季的檢出率分別為7.35%、13.33%、13.33%，在冬季檢出率最高，達到16.22%，與往年閩西地區檢出情況相比，RV在冬季的檢出率呈現出上升趨勢，而在春、夏、秋季，RV的感染情況沒有明顯變化。TGEV的檢出率與全國大部分地區的情況相近，與2012—2013年閩西地區TGEV感染情況相比，檢出率有所下降[6]。通過對不同年份陽性檢出率統計發現，閩西地區PEDV感染率在近些年呈現下降趨勢，感染情況有所好轉。TGEV在2015年后感染率下降顯著，并保持較為穩定的感染情況。而RV的感染率總體波動不大，這也與我國部分省(市、區)RV感染情況相近。

本研究顯示，當前閩西地區以PEDV最為流行，對養殖業影響較大，造成經濟損失更為嚴重，應當受到高度重視。同時，TGEV和RV的感染率雖然相對較低，仍然應當加強防控，不可掉以輕心。因此，在養殖中應當加強預防力度，通過合理使用藥物提高豬群抵抗力，做好免疫接種[10]。從流行特點來看，病毒的流行與季節氣候有一定聯系，一般在冬、春季較寒冷潮濕的時期多發。冬、春季節由于氣候多變，濕度大，作為傳染源的糞便、乳汁和呼出的氣體等在潮濕的環境下更容易傳播病毒，攜帶病毒的傳染源污染環境、飼料、飲水和用具，轉而傳入易感群體的消化道和呼吸道[11]。因此，冬春2季更要謹防病毒的滋生，減少應激，提高飼料營養，改善飼養管理，嚴格維持舍內干燥清潔，定期消毒通風。同時，應適當調整豬舍密度，以便降低傳播速度，對于哺乳仔豬更應加強護理。