甘薯幾丁質酶的性質研究

張 健，王景景，謝逸萍，劉美艷

(1.江蘇師范大學生命科學學院/整合植物生物研究所，江蘇徐州 221116； 2.中國農業科學院甘薯研究中心，江蘇徐州 221121)

甘薯(IomoeabatatasLam)屬旋花科甘薯屬，是重要的糧食、經濟和飼料作物，在全世界范圍內廣泛種植[1-3]。我國是甘薯種植面積最大的國家，占世界種植面積的一半以上。甘薯黑斑病是危害甘薯種植和儲藏的重要病害之一，在世界各地甘薯產區均有發病[4]。甘薯黑斑病使幼苗期和生長期苗莖基部黑根爛死，儲藏期感染則會使薯塊出現黑斑，味苦，最后全部腐爛[5]，使甘薯失去應用價值。甘薯黑斑病病原菌為CeratocystisfimbriataEllis et Halsted，屬于真菌病害。植物病程相關蛋白(pathogenesis-related protein，PRs)是當植物體受病原菌等刺激物刺激后產生的一類蛋白質，正常情況下含量并不高，一旦被誘導，含量迅速增加從而提高植物對病蟲害等逆境的防御抵抗能力[6-7]。國內外的研究表明，植物幾丁質酶被認為是一類與植物抗病有著密切關系的病程相關蛋白，它參與了植物體內防御機制的很多方面[8-9]。大量研究表明，植物幾丁質酶是一類次生代謝物，只有在真菌或病毒的誘導刺激下才會大量積累，積累到一定量時作用于真菌等病害，抑制其生長或直接將其殺死來提高植物的抗逆能力[10-12]。本試驗的前期工作已經利用甘薯黑斑病病菌誘導甘薯大量表達了幾丁質酶，說明甘薯黑斑病抗性與甘薯塊根幾丁質酶活性有相關關系。核黃素、脫乙酰幾丁質、黑斑病病菌處理均能誘導甘薯塊根幾丁質酶活性的提高，說明甘薯幾丁質酶是一種誘導酶。體外抑菌試驗結果顯示，甘薯幾丁質酶對甘薯黑斑病病菌具有很強的抑制作用[13]。進一步研究甘薯幾丁質酶的性質，能為甘薯抗黑斑病育種[14]、新型抗黑斑病藥物的開發和生產上黑斑病的防治[15]提供理論根據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甘薯黑斑病病菌、南京-92塊根(高抗黑斑病品種)由江蘇省徐州市農業科學院中國甘薯研究中心提供。

1.2 黑斑病菌孢子懸液的制備

取滅菌過的PDA液體培養基200 mL，接種甘薯黑斑病菌于其中，在(30±1) ℃下，以120 r/min振蕩3 d，過濾除去菌絲，以3 000 r/min離心10 min，重復3次，直至沉淀基本為白色，經鏡檢確認為黑斑病菌內分生孢子，加適量水懸浮。試驗時，將上述內分生孢子配成1×107個孢子/mL的濃度供接種用。

1.3 薯塊染菌處理

試驗時，選取大小均勻、表面光潔無病斑的塊根，用蒸餾水沖洗3次。將塊根切成1～2 cm厚的圓片，然后將黑斑病菌內分生孢子懸浮液涂于塊根圓片的兩側，于(30±1) ℃暗箱中保溫4 d。

1.4 甘薯幾丁質酶的提取和活力測定

將甘薯外表層去除，切成小塊，并迅速將其浸泡于 0.02 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH值5.5)中，甘薯質量和緩沖液體積的比例為1 ∶1，用組織搗碎機將甘薯磨碎，4層紗布過濾，濾液于4 ℃下以8 000 r/min離心15 min，上清即為幾丁質酶粗酶液。膠體幾丁質的制備按照李世貴等的方法[16]進行。DNS溶液的配制按照李合生的方法[17]進行。幾丁質酶活性測定參照Boller等的方法[7]進行。以每小時分解膠體產生1 μmolN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個酶活力單位(U/mL)。

1.5 甘薯幾丁質酶的分子量測定

采用SDS-PAGE測定分子量，按蔡武成等的方法[18]進行。

1.6 甘薯幾丁質酶的等電點測定

采用圓盤電泳，按蔡武成等的方法[18]進行等電點測定，兩性電解質pH值為7～10。

1.7 甘薯幾丁質酶的最適溫度測定

分別于10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃下測定幾丁質酶活性，3次重復。以溫度為橫坐標，幾丁質酶活性為縱坐標，得出甘薯幾丁質酶活性隨溫度變化的曲線。

1.8 甘薯幾丁質酶的最適pH值測定

幾丁質酶活性測定體系的pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。其中pH值2.0～6.5是用0.02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH值7.0～12.0是用0.02 mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。3次重復。以pH值為橫坐標、幾丁質酶相對活性為縱坐標，得出甘薯幾丁質酶活性隨pH值變化的曲線。

2 結果與分析

2.1 甘薯幾丁質酶的分子量

從高抗甘薯黑斑病品種南京-92塊根得到粗酶液。經熱變性、硫酸銨分級沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析、SephadexG-75凝膠層析純化后，將有幾丁質酶活性的條帶進行10%、12%PAGE電泳，均顯示為單一條帶(圖1)；說明制備得到了電泳純級的甘薯幾丁質酶單一組分。將割膠純化后得到的幾丁質酶進行SDS-PAGE電泳(圖2)，根據低分子量標準蛋白計算可知甘薯幾丁質酶相對分子量為23 ku。

2.2 甘薯幾丁質酶的等電點

以凝膠距正極的距離為橫坐標，每0.5 cm凝膠的pH平均值為縱坐標制作pH值梯度曲線(圖3)。得出回歸方程為y=0.253 2x+7.019 5，r2=0.992 9。幾丁質酶經圓盤等電聚焦電泳得到1條蛋白帶(圖4)，圓盤等電聚焦電泳膠總長 8 cm，蛋白條帶距負極端0.7 cm。根據等電聚焦的標準曲線確定等電點為pH值7.2，說明該蛋白為堿性蛋白質。

2.3 甘薯幾丁質酶的最適溫度

從圖5中可以看出，甘薯幾丁質酶在10～70 ℃之間都有較強的活性，45 ℃時酶活性達到最大，說明45 ℃為是甘薯幾丁質酶的最適溫度。

2.4 甘薯幾丁質酶最適pH值

從圖6中可以看出，甘薯幾丁質酶在pH值4.0～10.0之間都有較強的活性，說明甘薯幾丁質酶對于酸堿的耐受力較強；在pH值為2.0時，此酶完全失去活性，而在pH值為12.0左右時幾丁質酶還保留一些活性；在pH值為5.5時，酶活性達到最大，說明pH值5.5為此酶的最適pH值。酶活性在pH值為6.5～7.5 之間下降，主要原因是pH值接近等電點，蛋白質發生部分沉淀，造成酶活性減小。

3 結論與討論

本試驗對純化得到的甘薯幾丁質酶的特性進行了研究。SDS-PAGE電泳顯示甘薯幾丁質酶的分子量在23 ku左右，這與已報道過的植物幾丁質酶的分子量在20～40 ku之間的結果一致。本試驗結果表明，甘薯幾丁質酶最適反應溫度為 45 ℃，在20～70 ℃時比較穩定，當溫度超過75 ℃，酶的活性急劇下降；該酶的最適pH值為5.5，在pH值為4.0～10.0比較穩定，說明純化的這種甘薯幾丁質酶對酸堿的耐受性較強，當pH值小于或等于2.0時幾丁質酶失去活性，pH值超過12.0時活性接近于0；該幾丁質酶的等電點為7.2，為堿性幾丁質酶，這與在甘蔗[19]和中國水仙[20]中分離得到的幾丁質酶的研究結果一致。

本試驗只純化了一種甘薯幾丁質酶，由外切幾丁質酶活性測定方法可知，這種幾丁質酶為外切幾丁質酶。很多研究表明，植物體內可能存在不止一種幾丁質酶[21]，本試驗的目的是要獲得對甘薯黑斑病病菌有較強抑制作用的幾丁質酶，并且通過體外抑菌試驗證明這種幾丁質酶對黑斑病有較強的抑制作用，對甘薯體內可能存在的其他同工酶將作進一步的研究。