低值魚調味品發酵過程分子量分布的變化

霍奕璇

（遼寧省鞍山市工業研究院，遼寧 鞍山 114000）

魚類水解蛋白是水解動物蛋白的一種，除了保持了原本的營養成分外，由于蛋白質被水解，成為大量的易溶于水的游離氨基酸以及一些呈味肽，這樣不僅使其風味口感更佳同時也更易被人體所消化吸收，產品特征風味的不同主要取決于其氨基酸種類以及配比。在各類海產品中，因品種的不同，蛋白質的氨基酸組成也隨之不同，特別是游離氨基酸的組成更顯差異，因此海產品風味的不同主要取決于其不同原材料中游離氨基酸的組成。

1 材料與方法

1.1 材料

鳳尾 魚 （干）、麩 皮、米 曲 霉As 3.042、黑 曲 霉As 3.350。

1.2 儀器和設備

選取SYQ.DSX－280B手提式的不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，722s的分光光度計，pHS－3C的精密pH 計，DK－S26電熱恒溫型水浴鍋，KQ－500DB數控超聲波清洗器等。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備培養基

1.3.1.1 馬鈴薯培養基（培養霉菌）的配制

土豆0.2kg，蔗糖0.02kg，瓊脂0.02kg，水1L。

土豆去皮，切成1cm的正方塊，然后加水煮沸約0.5h，通過紗布進行過濾，并在濾液中加一定量的蔗糖和瓊脂，待完全溶解補水直到1L，分裝后濕熱滅菌121℃條件下，0.5h［1］。

1.3.1.2 麥芽汁培養基（培養酵母菌）的配制

首先，向磨碎后的麥芽中加約0.8L的水，然后在鍋中（60～65℃）進行糖化，時間控制在3～4h，直到麥芽汁再無淀粉反應。均勻攪拌后進行煮沸過濾，最后調節麥芽汁糖度，控制在8～10，最后進行濕熱滅菌121 ℃，30min［2］。

1.3.2 樣品的制備

先將低值魚平均切成0.5cm的小塊，然后與麩皮進行混合，并蒸料殺菌（121℃，30min），冷卻直到室溫后接菌，菌種比例為As3.042∶As3.350為3∶1，種曲的接種量為1%，培養溫度為30℃，72h出曲后進行接種，發酵溫度最好為室溫（發酵歷經8月至次年的3月，室溫從29℃變化到20℃），加入料液比約為1∶2.3的18°Bé的鹽水，并進行高鹽稀態發酵，在發酵31天左右時加入耐鹽酵母2.297，接菌量2%。

1.3.3 多肽的粗分離及其分子量的測定

將已選定的蛋白標準品通過凝膠過濾層析的時間可以測定出未知樣品的分子量。制作標準曲線的方法為以標準蛋白的洗脫體積以及標準蛋白分子量的對數作為標準曲線，在進行標準曲線方程后，根據樣品自身不同的洗脫體積，可以清晰準確地算出組分的分子量［3］。

首先測定出已選定的葡聚糖凝膠G－50的吸光度值A（在紫外280nm的條件下）。確保洗脫條件大致相同，洗脫標準的樣品液為L－酪氨酸、桿菌肽、中性胰島素以及細胞色素C，進行測定并逐項記錄每一個收集管中溶液的吸光度值A，以吸光度的值作為坐標的縱坐標，洗脫體積作為坐標的橫坐標，然后繪制出標準的洗脫曲線。按照每一組的洗脫體積，同時對照標準的洗脫曲線，可以準確地計算出相應分子量的大小。

2 結果與分析——多肽的粗分離及其分子量

2.1 采用Sephadex G－50對發酵90天的樣品進行粗分離

本實驗采用1.7cm×60cm規格的Sephadex G－50葡聚糖凝膠柱，該凝膠柱適用于粗分離分子量介于30～1.5kDa的樣品，以0.9mol/L的NaCl溶液為洗脫液，首先對樣品的上樣以及其他條件進行優化調整。

2.1.1 上樣量的確定

按照凝膠柱的安裝要點裝柱后，凝膠柱的有效柱長為44cm，凝膠柱的規格為1.7cm×60cm，因此計算出凝膠柱的有效柱長體積為99.8mL，按照規定的要求，確定上樣量應為柱床體積的1%～5%，因此對上樣量范圍限定為1～5mL。選擇分別為1，2mL的上樣量，流速設定為0.6mL/min，單試管的收集量約為2.4mL，見圖1和圖2。

圖1 上樣量為1mL的洗脫曲線Fig.1The elution curve of loading quantity of sample of 1mL

圖2 上樣量為2mL的洗脫曲線Fig.2The elution curve of loading quantity of sample of 2mL

由圖1和圖2可知，當上樣量為2mL時，樣品相對過多，第1個峰和第2個峰并沒有完全地進行分開，并且在60～80管中間，存在“拖尾”的現象，分離效果遠不如上樣量為1mL時的效果好；因此對比曲線分析，建議選擇上樣量為1mL。

2.1.2 流速的確定

設定的流速分別在0.4，0.6mL/min，并將兩管的收集體積均設置在2.4mL，見圖3和圖4。

圖3 當流速設定為0.4mL/min時的洗脫曲線Fig.3The elution curve when the flow rate is set to 0.4mL/min

圖4 當流速設定為0.6mL/min時的洗脫曲線Fig.4The elution curve when the flow rate is set to 0.6mL/min

由圖3和圖4可知，當流速設定為0.4mL/min時，洗脫到30管左右時，可以看到兩峰之間有重疊現象，分離速度過慢導致分離效果不好；流速為0.6mL/min時的洗脫曲線峰形較好，峰形明顯，有4個組分被分離出來，因此選擇流速為0.6mL/min。

綜上所述，本實驗采用1.7cm×60cm的Sephadex G－50葡聚糖凝膠洗脫樣品，用0.09mol/L的溶液進行洗脫，分離的條件設定為：上樣量設定為1mL，流速設定為0.6mL/min，洗脫液的接受容量約為2.4mL。樣品分離成為4組組分，最大的吸收峰出現在第24管、34管、43管和61管。

2.2 發酵90天樣品的分子量

標準品的分子量：通過牛血清白蛋白、細胞色素C、中性胰島素、桿菌肽做標準曲線。各標準樣品洗脫曲線見圖5～圖8。

圖5 牛血清白蛋白洗脫曲線Fig.5The elution curve of BSA

圖6 細胞色素C洗脫曲線Fig.6The elution curve of cytochrome C

圖7 中性胰島素的洗脫曲線Fig.7The elution curve of neutral insulin

圖8 桿菌肽洗脫曲線Fig.8The elution curve of bacitracin

各標準品出峰的管數及洗脫體積與分子量之間的關系見表1。

表1 標準品的洗脫體積和分子量間的關系Table 1The relation between molecular weight and elution volume of the standard substance

根據相應的標準品分子量對數和洗脫體積，得出標準洗脫曲線，見圖9。

圖9 分子量的標準曲線Fig.9The standard curve of the molecular weight

由圖9可知，回歸方程Y＝5.47145－0.0165X，相關系數為R2＝0.9940。按照小分子肽分離組分中最大的吸收峰為第24管、第34管、第43管和第61管，可以計算出其分子量分別為33193.17，13336.75，6430.578，1137.274Da。由分子量可知，組分中含有尚未被分解的蛋白質、長鏈多肽。根據出峰位置可以算出，分子量分布在30000Da左右的肽段，占所有分離組分的2.36%，分子量分布在10000Da的肽段占所有分離組分的8.66%，分子量分布在10000～2000Da的肽段占所有分離組分的82.88%，分子量分布在1000～2000Da的肽段占所有分離組分的5.66%。

2.3 采用Sephadex G－50對發酵180天樣品進行粗分離

圖10 上樣量為1mL的洗脫曲線Fig.10The elution curve of input 1mL

由圖10可知，明顯有4個峰形。分為第25管、33管、42管和62管。根據標準洗脫曲線方程，我們可計算出其分子量分別為30300.52，14609.99，6430.578，1004.015Da。本實驗采用微積分原理，結合本實驗繪制洗脫曲線的全過程，上面的兩個點之間所形成的圖形類似看作梯形，梯形的上部分與平滑曲線之間部分可以忽略不計；將所有組成的梯形進行相互疊加，與得到的洗脫曲線峰的總面積比較。通過出峰位置的管數可以算出，分子量在30000Da左右分布的肽段占所有分離組分的2.04%，分子量分布在10000Da的肽段占所有分離組分的9.31%，分子量分布在10000～2000Da的肽段，占所有分離組分的83.58%，分子量分布在1000～2000Da的肽段占所有分離組分的5.06%。

對比不同發酵時間下的分子量分布可知，隨著時間的延長，分子量分布在30000Da左右的肽段，所占比例有下降趨勢，從發酵90天的2.36%下降到2.04%；分子量分布在10000Da的肽段，所占比例有上升趨勢，從90天的8.66%上升到9.31%；分子量分布在10000～2000Da的肽段，所占比例有上升趨勢，從90天的82.87%上升到83.59%；分子量分布在1000～2000Da之間的肽段，相應比例呈現下降趨勢，從90天的6.10%下降到5.06%。但整體趨勢變化并不顯著，呈動態平衡狀態，這是因為在發酵的過程中，在相應的酶的催化作用下，大分子中的肽慢慢地降解成為小分子的肽，甚至降解成為游離氨基酸。同時，小分子中的肽也進一步降解，逐漸成為游離氨基酸，某一肽段所占比例的升高都會引起另一肽段所占比例的下降。

3 小結

總體看來，不同發酵時間下的肽段主要集中在2000～10000Da，占所有肽段的80%。變化不顯著主要是由于在發酵的后期，中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力逐漸降低，對蛋白質的生成和降低所發揮的作用逐漸減小，其大分子中肽段開始降解的速度和小分子中肽段開始生成的速度達到了動態平衡，所以發酵后期變化較小。

分子量1000Da的肽段比例呈下降趨勢，說明部分肽段越來越多地降解為游離氨基酸，這與氨基態氮的升高呈一定的負相關性。

隨著小分子量的肽段逐漸增多，發酵液的風味愈發豐富，這是由于大量呈味氨基酸的溶出和生成，其中常見的氨基酸如天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、等都極具鮮味。其中鮮味最為強烈的當屬谷氨酸；呈甜味的氨基酸中含有甘氨酸、蘇氨酸、色氨酸、脯氨酸、丙氨酸等；再加上發酵過程中產生的琥珀酸、丁酸、乳酸、戊酸、異戊酸、檸檬酸以及醇類和有機酸等生成的酯類等，最終形成低值魚調味品的風味。