響應面法優化酸甘藍發酵條件

董靜，姚妙愛

（江蘇財經職業技術學院，江蘇 淮安 223003）

酸甘藍作為一種傳統的發酵蔬菜腌制品，其酸香味鮮，口感脆爽，不僅可以直接食用，還可用于制作美味的漬菜粉、酸菜湯。具有開胃除膩，增進食欲，幫助消化的功效，能夠促進人體對鐵等礦質元素的吸收，并且其發酵和生產過程簡單，人們對此都津津樂道［1，2］。酸甘藍主要是通過乳酸發酵而成，不僅保留了VC、氨基酸、有機酸以及膳食纖維等原料原有的營養成分，還含有乳酸菌等功能性微生物［3］，隨著人們進一步揭示了乳酸菌對人體健康有益作用的機理，酸菜生產與加工引起了國內外的高度重視。

隨著微生物技術的發展，酸甘藍工藝有了不同程度的改變，對發酵劑、食鹽濃度進行了大量的研究，Elena Peas等研究發現酸甘藍質量好和生物胺含量最低的最佳發酵條件是腸膜明串珠菌和0.5%食鹽濃度［4］。韓國玲等提出發酵劑5%乳酸菌純培養物［5］，發酵溫度20～25℃，發酵時間20天條件下發酵的酸白菜在感官指標上有明顯改善；祝戰斌等認為采用鹵汁食鹽質量分數為2.25%［6］，白糖質量分數為5%，發酵溫度為22℃，發酵接種量為1%的自然發酵結合人工接種發酵甘藍泡菜具備自然發酵風味好、人工接種時間快的優點。

由于酸甘藍發酵過程中會產生亞硝酸鹽，令許多消費者望而生畏，我國衛生標準規定，醬腌菜中亞硝酸鹽含量不得超過20mg/kg，降低酸甘藍中亞硝酸鹽的含量是其工業化生產必須要解決的問題。本研究以酸甘藍的感官指標、營養指標、安全指標、生產周期等綜合評價為指標值，研究了適宜于工業化實施的食鹽添加量、接種量、發酵溫度等發酵條件對酸甘藍綜合品質的影響并對其發酵條件進行了優化，這將對酸甘藍工業化、標準化、規模化生產具有重要的指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

結球甘藍（包菜）：購于淮安農貿市場；

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）：遼寧省農業科學院微生物實驗室提供；

泡菜鹽：江蘇省鹽寶鹽業有限公司。

1.1.2 試劑

碳酸氫鈉、抗壞血酸、乙酸鋅、冰醋酸、亞鐵氰化鉀、硼酸鈉、鹽酸、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、硝酸鈉、氨水、草酸、2，6－二氯靛酚、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉、檸檬酸二胺、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、磷酸氫二鉀、瓊脂（均為國藥分析純）。

MRS液體試管培養基：蛋白胨1.0g，葡萄糖5.0g，牛肉膏1.0g，酵母膏0.5g，乙酸鈉0.5g，硫酸錳0.025g，檸檬酸二胺0.2g，硫酸鎂0.02g，吐溫80 0.1g，磷酸氫二鉀0.2g，加蒸餾水至100mL，pH 6.2～6.4，121℃，15～20min滅菌［7］。

MRS固體試管培養基：在MRS液體培養基基礎上加瓊脂2g。

1.2 儀器與設備

DZQ400－2D真空包裝機 昆山康佳包裝機械有限公司；SW－CJ－2F超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；LDZX－50FA滅菌鍋、LHS－150SC電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；PHS－3C酸度計 上海世義精密儀器有限公司；FA1004電子天平 上海精密科學儀器有限公司；S22PC可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；HH－D4型數顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實驗儀器廠；組織搗碎機：HR2095飛利浦攪拌機 飛利浦（中國）投資有限公司；50L雙層內蓋塑料桶 山東慶云普利塑料制品銷售中心。

1.3 方法

1.3.1 酸甘藍加工工藝

1.3.1.1 酸甘藍加工工藝流程

1.3.1.2 發酵劑的制備

固體試管菌種活化：將本實驗室篩選后保存在冰箱中的固體菌種穿刺接種到固體MRS試管培養基中，在37℃下培養24h，得活化菌種。

液體試管菌種制備：將培養好的固體試管中的菌種接種到盛有5mL液體MRS培養基的20mm×200mm試管中，混勻后放入恒溫培養箱中37℃下培養24h。

液體培養瓶菌種制備：將培養好的液體試管中的菌種按2%（V/V）接種到盛有1L液體MRS培養基的1L培養瓶中，混勻后放入恒溫培養箱中37℃下培養24h。

種子罐菌種制備：甘藍經整理、清洗，縱向切開，裝滿5L泡菜壇，按2%接入培養好的液體培養瓶中菌種，加入1%（W/V罐）食鹽水溶液灌滿，于30℃培養，發酵期間保持菜在發酵水以下，直至發酵水pH達到3.5。

1.3.1.3 加工操作要點

甘藍挑選、修整、清洗：挑選新鮮、成熟、無病蟲害的甘藍，除去外葉、老葉，挖掉根芯，清洗干凈。

裝罐、發酵：將清洗干凈的甘藍裝滿50L發酵桶，1層菜1層鹽，接入種子罐菌種，菌種分3次添加，裝滿后用木板壓蓋，加入自來水將發酵桶灌滿，菜在液面以下，在發酵液表面蓋上塑料薄膜，保持厭氧發酵。

切絲：將發酵好的甘藍放入切菜機將酸甘藍切成1.5～2mm寬的細絲［8］。

包裝：將發酵好的甘藍絲去除多余的水分，以每袋300g進行真空塑料包裝。

1.3.2 酸甘藍發酵終點判斷

酸甘藍pH值達到3.5以下，每袋裝入酸甘藍300g真空包裝，置于30℃下培養2天不脹袋。

1.3.3 酸甘藍感官品質評定方法

由10人組成品評小組，按照評分標準表，通過感官評價酸甘藍產品的色澤、香氣、質地和滋味，并做好記錄，以感官綜合評分判定產品的感官品質［9］，色澤滿分25、香氣滿分25、滋味滿分25、質地滿分25，具體評分標準見表1。

表1 酸甘藍感官品質評價標準Table 1Criteria for sensory evaluation of sauerkraut

1.3.4 酸甘藍綜合品質統計方法

綜合品質的統計分析采用模糊綜合評判法［10］，以感官評分（u1）、亞硝酸鹽含量（u2）、酸度pH（u3）、維生素C含量（u4）、發酵時間（u5）作為評價因素，評價因素U＝｛u1，u2，u3，u4，u5｝建立評價因素隸屬函數，以各因素在不同處理間的最大值為基準，即max＝｛ui1，ui2，ui3，ui4，ui5｝＝uib，通過隸屬函數得出U的模糊矩陣因素值具有均一可比性。權重系數根據各因素的重要性來給定，本文的權重系數中感官品質0.4，亞硝酸鹽含量0.2，pH 值0.1，維生素C含量0.2，發酵時間0.1，所有權數之和為1。權重系數矩陣 M＝（0.4，0.2，0.1，0.2，0.1），評價結果為V＝MR，根據V的大小來判斷綜合品質的相應優劣。其中亞硝酸鹽含量的數值越小，對人體的危害越小，綜合品質越高；pH值越低說明酸甘藍酸味越濃，綜合品質越高；發酵時間越短，生產效率越高，綜合品質越高。因此，為了品質優劣的一致性，將亞硝酸鹽含量、pH值、發酵時間的數值顛倒，亞硝酸鹽含量、pH值、發酵時間的隸屬函數為

1.3.5 單因素試驗

在發酵罐中按照1%（W 鹽∶V罐）食鹽、2%（V菌種∶V罐）接種，30℃發酵，直至發酵結束，評定酸甘藍的感官品質，測定酸甘藍中維生素C、亞硝酸鹽含量，測定pH值，記錄發酵時間。分別考察食鹽添加量 （0，0.5%，1%，2%，3%）、接種量（0，0.5%，1%，2%，5%，10%）、發酵溫度（10，15，20，25，30 ℃）對酸甘藍綜合品質的影響，平行3次試驗，取平均值。

1.3.6 響應面分析法

確定影響酸甘藍發酵的關鍵因素后，用Design Expert軟件（Vision 7.1.3，Stat－Ease.Inc.，Minneapolis，MN.USA）設計試驗，采用Box－Behnken法，以確定最優發酵條件。本文在單因素試驗基礎上，以食鹽添加量、接種量、發酵溫度3個因素為自變量，以酸甘藍綜合品質評價V值為響應值，設計三因素三水平試驗，共計17個試驗點，通過試驗數據的二次回歸擬合分析得到各因素與響應值間的回歸方程，分析各因素與響應值間的主效應、因素間的交互效應得到最佳響應值，最終確定酸甘藍發酵的最佳發酵條件，因素水平選取見表2。

表2 響應面因素與水平Table 2Factors and levels of response surface

1.3.7 檢測方法

維生素C含量的測定：采用GB/T 6195－1986的2，6－二氯靛酚滴定法。

亞硝酸鹽含量的測定：采用 GB 5009.33－2010的鹽酸萘乙二胺法。

pH值的測定：采用pH計法，將酸甘藍榨汁，使用精密pH計測定汁液的pH值。

2 結果與分析

2.1 食鹽添加量對酸甘藍綜合品質的影響

在其他因素相同的條件下，加鹽量不同可以控制微生物生長及它們在食品發酵過程中的活動［11］；適宜的食鹽濃度不僅可以抑制有害菌的生長，增加保質期，具有防腐作用，還可以增加食品的獨特風味。甘藍在腌制時分別加入不同量的食鹽，最終產品的感官評分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量及綜合品質見表3。

表3 不同食鹽添加量下酸甘藍各品質指標測定值及綜合品質Table 3Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different salt content

由表3可知，食鹽的添加量為0.5%時，酸甘藍的感官品質評分最高，Vc保存最好；食鹽的添加量為1%時，酸甘藍的感官品質評分較高，亞硝酸鹽含量最低，酸度最低，發酵時間最短。食鹽的添加量在1%時，酸甘藍的綜合評價值為0.725，綜合品質最好。因此，選用食鹽添加量1%作為較優添加量。

2.2 接種量對酸甘藍綜合品質的影響

在發酵開始時接入大量的乳酸菌，可以迅速地生長繁殖，并且抑制雜菌的生長，促使乳酸發酵的進行［12］，適宜的接種量，可促使乳酸菌快速地繁殖，促進酸甘藍風味形成。甘藍在腌制時分別接入不同的接種量，最終產品的感官評分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量及綜合品質見表4。

表4 不同接種量下酸甘藍各品質指標測定值及綜合品質Table 4Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different inoculum size

由表4可知，當接種量為2%，5%時產品感官品質評分高，亞硝酸鹽含量低，pH較低，VC保存較好，發酵時間較短；當接種量為10%時Vc含量最高，發酵時間最短。發酵劑接種量為5%時，酸甘藍的綜合品質評估值為0.750，綜合品質最好，這與韓國玲以感官質量為指標值，確定的最佳接種量一致。因此，選擇發酵劑5%作為較優添加量。

2.3 發酵溫度對酸甘藍綜合品質的影響

酸甘藍的發酵主要是以乳酸發酵為主，其中的乳酸菌屬于中溫微生物，發酵溫度影響甘藍發酵時間和產品的最終酸度，分別測定不同發酵溫度下酸甘藍的感官評分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量、發酵時間和綜合品質，結果見表5。

表5 不同發酵溫度下酸甘藍的各品質指標值及綜合品質Table 5Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different fermentation temperatures

由表5可知，隨著發酵溫度的升高，亞硝酸鹽含量降低，Vc保存率升高，發酵周期縮短，生產成本降低。在20℃下發酵，酸甘藍的感官品質最好，酸度最低；在30℃下發酵，亞硝酸鹽含量最低，VC含量最高，發酵時間最短。當發酵溫度為25℃時，酸甘藍的綜合品質評估值為0.835，綜合品質最佳。賈樹彪認為在較低溫度下發酵效果較好，對發酵過程的起動與產品風味的形成有重要的作用，但發酵溫度過低，發酵時間長，生產成本高，VC保存率低。發酵溫度過高，發酵過程中極易引起雜菌的生長，引起酸甘藍腐爛變質、變色、變味，導致發酵管理困難。在不同的溫度下發酵甘藍，發酵結束時，酸甘藍中亞硝酸鹽的含量均遠低于國家標準，食用安全。因此，選擇25℃作為較優發酵溫度。

2.4 響應面法優化酸甘藍發酵工藝

2.4.1 二次回歸擬合及方差分析

利用Design－Expert統計分析軟件對響應面優化試驗方案與結果，見表6。

表6 Box－Behnken試驗設計與結果Table 6Experimental design and results of Box－Behnken

利用 Design Expert 7.1.3軟件對表6試驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得酸甘藍的綜合品質評價V對加鹽量、接種量以及發酵溫度的二次多項回歸方程：

V＝0.84－8.858E－003A ＋4.812E－004B＋0.071C＋0.026AB－3.534E－003AC＋0.018BC－0.072A2－0.048B2－0.15C2，對此回歸模型進行方差分析，結果見表7。

表7 方差分析表Table 7Results of regression analysis

由表7可知，該回歸模型P＜0.0001，表明該模型極顯著，能解釋酸甘藍綜合評價值的變化。各因素的一次項C為極顯著，二次項A2和B2為顯著，C2均為極顯著，交互項AB和BC為顯著，且失擬項不顯著，表明該模型與實際情況擬合很好，可用于預測酸甘藍的綜合品質。線性方程的相關系數R2＝0.9881，校正系數 R2＝0.9729，信噪比（Adeq Precision）＝22.077遠大于4，表明該模型的準確性、適用性較好，預測值與實際值擬合好，能夠很好用于酸甘藍綜合品質評價的分析和預測。由F值大小可知，影響酸甘藍綜合品質的因素主次順序為C＞A＞B，即發酵溫度＞食鹽添加量＞接種量。

2.4.2 試驗結果分析與優化

利用Design Expert軟件對表6中數據進行二次多元回歸擬合得到的二次回歸方程的響應面及其等高線見圖1～圖3。

圖1 食鹽添加量與接種量交互作用的響應面和等高線Fig.1The response surface and contour of the interaction between salt content and inculum size

由圖1可知，當發酵溫度一定時，食鹽添加量與接種量兩個因素之間交互作用顯著，食鹽添加量在高水平時，酸甘藍綜合品質的響應拋物曲線的最高點也處在較低水平，而隨著食鹽添加量的下降，酸甘藍綜合品質的響應拋物曲線的最高點向高水平方向移動。當接種量一定時，隨著食鹽添加量的增加，酸甘藍綜合品質先升高后降低，說明在低濃度食鹽時有利于接種乳酸發酵，鹽濃度過大增大反而抑制乳酸菌的生長。

圖2 食鹽添加量與發酵溫度交互作用的響應面和等高線Fig.2The response surface and contour of the interaction between salt content and fermentation temperature

由圖2可知，當接種量一定時，食鹽添加量與發酵溫度的交互作用不顯著。當食鹽添加量一定時，發酵溫度在20～25℃，隨著發酵溫度的升高，酸甘藍的綜合品質升高。發酵溫度在25～30℃，發酵溫度影響不顯著，隨著溫度的升高，酸甘藍的綜合品質降低，因為此溫度范圍為乳酸菌的適宜溫度，發酵快、時間短；但溫度過高，也易引起腐敗細菌、霉菌等有害微生物的生長，菜色澤變暗，風味變差。

圖3 接種量與發酵溫度交互作用的響應面與等高線Fig.3The response surface and contour of the interaction between inculum size and fermentation temperature

由圖3可知，當食鹽濃度一定時，接種量和發酵溫度交互作用顯著性較弱。酸甘藍綜合品質主要由發酵溫度決定，隨著發酵溫度的升高，酸甘藍的綜合品質先增大后減小。低接種量下，適宜的發酵溫度對酸甘藍綜合品質有利，因為接種量小、適宜的溫度可以使乳酸菌快速地生長繁殖，并抑制其他雜菌的生長，促使乳酸發酵的進行。

2.4.3 優化結果與驗證試驗

將酸甘藍綜合品質取最大值，通過Design Expert 7.1.3軟件自動分析得到最優條件：食鹽添加量1%、接種量5%、發酵溫度25℃，在此條件下進行3次平行驗證試驗，酸甘藍綜合品質V達到0.838。

3 結論

采用響應面法對酸甘藍的發酵條件進行優化，建立的二次多項式數學模型顯著性良好。酸甘藍發酵的最佳發酵工藝條件為食鹽添加量1%，接種量5%，發酵溫度25℃。在此發酵條件下，酸甘藍的感官品質得分為88，含亞硝酸鹽0.02mg/kg、Vc 4.34mg/kg，pH為3.25，發酵時間23天。