堿法預處理麥糟酶解轉化還原糖工藝研究

連戰，呂志飛，劉彬，劉欣，莊倩倩，劉同軍

（齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，濟南 250353）

麥糟是啤酒生產中數量最多的副產物，大約占到了所有副產物的85%左右。而我國作為啤酒生產大國，每年麥糟的產量高達500萬噸［1，2］。傳統的對于麥糟的處理方式諸如堆肥，作為粗飼料等方式利用率較低，且極易造成環境污染，一種合理利用麥糟的方式亟待研究［3－5］。

相關研究表明，麥糟富含纖維素與半纖維素，可通過預處理及酶解轉化為葡萄糖與木糖等還原糖，經分離純化后用于食品工業的生產，木糖可通過還原加氫生產木糖醇，且經過酶解法產生的麥糟酶解液，木糖與葡萄糖純度較高，副產物較少，還原糖分離純化難度相應得到降低［6－8］。與其他生物質資源相比，經過啤酒生產過程的麥糟，木質素含量下降，結構發生變化，對打破利用纖維素與半纖維素的生物質壁障有一定的效果，但仍然存在一定難度。有效的預處理方法、合適的酶解工藝都需要進一步的研究［9］。堿過氧化氫法能有效破壞木質纖維素結晶區，使孔隙率和內表面積增大，同時去除木質素，從而有效破除酶解產生可發酵糖的生物質壁障［10－12］。本文通過對低濃度與高濃度麥糟直接進行酶解，探究AHP預處理對麥糟酶解效率的影響，同時因經過啤酒釀造過程，麥糟成分與結構發生變化，AHP預處理的加堿量也需要重新進行優化。在堿過氧化氫法預處理的技術上進一步對麥糟進行水洗，去除酶活抑制物，以提高酶解轉化率，并在水洗的基礎上通過Mixture設計對多酶聯合酶解麥糟的加酶比例進行優化，為高效利用麥糟轉化還原糖提供一條有效的途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

麥糟：由齊魯工業大學（山東省科學院）工程訓練中心中德啤酒技術中心提供。

1.1.2 試劑

硫酸、5mol/L NaOH、H2O2：實驗試劑均為分析純。

1.1.3 酶

纖維素酶（ctec2）、半纖維素酶（htec2）與果膠酶：均來自丹麥諾維信公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 成分分析

纖維素、半纖維素、木質素、還原糖及其他主要成分測定參照美國國家可再生能源實驗室（NREL）Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass測定方法進行。

1.2.2 未預處理麥糟直接酶解

實驗選擇10%，15%，20%的底物濃度進行酶解。準確稱取3.0g麥糟于50mL三角瓶中，按照實驗設計底物濃度加蒸餾水并混勻，使用72%H2SO4調節pH至5.2，分別添加ctec2與htec2，添加量為50mg總蛋白/g纖維素，添加比例為0.77∶0.23［13］，混勻后置于50℃恒溫振蕩培養箱中170r/min振搖24h，酶解結束后沸水浴滅活3～5min，取樣1mL于1.5mL離心管中，12000r/min下離心3～5min，取上清液測定葡萄糖及木糖濃度。

1.2.3 堿過氧化氫法預處理加堿量的優化

實驗設計 NaOH 添加量為0.06，0.08，0.10g（NaOH/g麥糟），準確稱取3.0g麥糟置于50mL三角瓶中，按照實驗設計量稱取NaOH于小燒杯中，加適量蒸餾水溶解，稱取H2O2溶液（H2O2/麥糟添加比例為0.1g/g），將混合均勻的NaOH溶液加入盛有小麥秸稈樣品三角瓶中，混勻后加入 H2O2溶液，置于30℃恒溫振蕩器中振搖，每隔2h測定并記錄pH。預處理結束，用72%H2SO4調節pH 至5.2，按照1.2.2步驟酶解并取樣測定糖濃度。

1.2.4 不同底物濃度下麥糟酶解

在上述實驗條件下分別考察酶解底物濃度10%，15%，20%（W/V）下酶解效率的變化。預處理結束后，向預處理麥糟中添加72%H2SO4調節pH至5.2，按照1.2.2酶解步驟進行酶解并取樣測定糖濃度。

1.2.5 酶解時間對糖得率的影響

實驗設計底物濃度為25%，稱取9.0g麥糟于300mL三角瓶中，在上述實驗條件下進行預處理及酶解，并在酶解12，24，36，48，72h分別取樣測定糖濃度。

1.2.6 水洗對麥糟酶解糖得率的影響

準確稱取15.0g麥糟于300mL三角瓶中，按照

1.2.3進行預處理，實驗設計底物濃度為25%。預處理完畢后置于16層細密紗布上，1.5L蒸餾水多次沖洗至滴下液體無色。擠壓去除水分，準確稱取0.50g擠壓后的底物，恒溫干燥箱105℃烘干4h后稱重并計算含水量，補水至原有底物濃度（25%），調節pH至5.2，按照1.2.2步驟進行酶解，取樣測定糖濃度并計算轉化率。

1.2.7 基于響應面法三酶聯合酶解水洗麥糟的Mixture實驗設計

以水洗后AHP預處理的麥糟為底物，酶解葡萄糖轉化率為考察指標，使用 Design－Expert 8.0（DX8）軟件進行Mixture實驗設計，優化纖維素酶（ctec2）、半纖維素酶（htec2）與果膠酶的添加比例。預處理及酶解按照1.2.3與1.2.4步驟進行。按照方案進行實驗并通過軟件進行分析，并對最佳加酶方案進行驗證實驗。

1.2.8 測定與計算

葡萄糖及木糖的糖濃度通過高效液相色譜進行測定，色譜柱為美國伯樂Aminex－87H色譜柱。檢測器為示差－折光檢測器，流動相為0.005mol/L H2SO4，柱溫為65℃，流速為0.6mL/min。通過建立標準曲線對糖濃度進行計算。

纖維素→葡萄糖、半纖維素→木糖酶解轉化率分別按公式（1）與公式（2）計算。

式中：0.9為纖維素到葡萄糖的轉化系數；0.88為半纖維素到木糖的轉化系數。

2 結果與討論

2.1 成分分析

采用NREL法進行成分分析，結果見圖1。傳統的生物質煉制原料多使用玉米、小麥等作物秸稈，與玉米秸稈30%～36%的纖維素含量，20%～26%的半纖維素含量、小麥秸稈31%～35%的纖維素含量，21%～25%的半纖維素含量相比［14－17］，麥糟纖維素及半纖維素含量相對較低，但經過啤酒生產發酵的過程，木質素含量明顯下降，酶解的生物質壁障在一定程度上被破壞，意味著預處理難度的降低，選擇合理的預處理及酶解方式，會獲得相對理想的糖得率。

圖1 麥糟成分組成

2.2 堿過氧化氫法預處理加堿量的優化

對堿過氧化氫法加堿量優化pH監測結果見圖2。不同加堿量下pH變化趨勢大致保持一致：在向麥糟中加入預處理液并攪拌均勻后，0.06，0.08，0.10g加堿量起始pH 分別為11.45，11.65，11.78，在1h后pH迅速上升，在4h左右達到峰值（0.06g加堿量下為1h），4h后pH逐步下降，pH的下降與預處理過程中NaOH與H2O2聯合作用被逐步消耗有關。三者在24h預處理后pH分別下降至11.18，11.94，12.38。

圖2 不同加堿量預處理pH變化

在不同加堿量下的酶解糖轉化率見圖3。在0.06g/g NaOH 添 加 量 下 轉 化 率 明 顯 低 于0.08，0.10g/g NaOH添加量，三者的葡萄糖轉化率分別為89.55%，93.17%，93.36%，NaOH 添加量從0.06g/g 增加到0.08g/g時，葡萄糖轉化率提升了3.62%，而繼續增加NaOH添加量至0.10g/g，葡萄糖轉化率僅提升0.19%，增幅很小。相關研究表明，在堿過氧化氫預處理中，增加堿及過氧化氫添加量能有效提高酶解轉化率，在pH 11.5附近進行預處理能獲得較高的糖得率，但也有研究表明最適pH水平要高于11.7，同時不同的pH下過氧化氫的量也有所不同，這與木質纖維素原料的特性以及反應的底物濃度有關［18］，0.08g/g添加量下整體pH水平與這類研究接近。實驗結果表明0.08g/g的堿添加量能獲得較高的糖轉化率，再增加NaOH添加量，對于轉化率提升效果較小，且會增加預處理成本。

圖3 不同加堿量預處理對酶解糖轉化率的影響

2.3 AHP預處理對麥糟酶解效果的影響

未經預處理直接進行酶解的麥糟糖得率見圖4。在10%底物濃度下，葡萄糖及木糖轉化率分別達到了54.4%，56.68%。隨著底物濃度的增加，糖濃度逐步升高，而轉化率迅速下降，到20%底物濃度，葡萄糖及木糖轉化率降低至44.7%，47.4%，而經堿過氧化氫預處理的同底物濃度組轉化率則達到了74.5%，60.7%，分別提高29.8%，13.3%，轉化率大幅提高。李夏蘭等采用較低濃度酸堿預處理麥糟，在1∶40固液比（W/V）下獲得酶解糖轉化率為78.5%，且其反應體系底物濃度較低［19］，明顯低于本實驗中10%底物濃度（相當于固液比1∶10）84.1%的纖維素酶解轉化率。實驗結果表明堿過氧化氫法能有效提高麥糟酶解轉化率，獲得的酶解液糖得率明顯提高。

圖4 AHP預處理對不同底物濃度酶解效率的影響

2.4 酶解時間對麥糟糖得率的影響

酶解時間對糖轉化率的影響見圖5。在0～12h，纖維素與半纖維素不斷轉化成葡萄糖以及木糖，隨著液化的進行，轉化率迅速提高。12～24h，葡萄糖及木糖轉化率分別達到了69.4%，57.5%，之后迅速進入平臺期。隨著糖及抑制物濃度的升高，轉化率增速明顯放緩，并在24～48h開始趨于穩定。48～72h，轉化率變化較小，72h后轉化率水平基本穩定。在24h，葡萄糖與木糖轉化率達到穩定的水平，葡萄糖與木糖濃度分別超過40，25g/L，還原糖產率及酶解效率較好，以24h作為酶解反應周期較理想。

圖5 酶解時間對糖轉化率的影響

2.5 水洗對麥糟酶解糖得率的影響

對25%底物濃度下AHP預處理麥糟進行水洗后酶解轉化率見表1。

表1 水洗對高底物濃度麥糟轉化率的影響%

經過水洗，葡萄糖與木糖轉化率均有明顯提升，分別提升了6.43%，3.87%。轉化率的提升與水洗去除了部分酶活抑制物（阿魏酸、對香豆酸等）以及水洗后明顯降低的液體粘度、明顯提高的傳質效率有關。水洗在對抑制物去除的同時也帶來了固形物的損失，擠壓帶來的木質纖維素角質化等不良影響，減少了固形物損失，則轉化率將大幅提升。

2.6 纖維素酶、半纖維素酶與果膠酶復合酶解Mixture設計

以酶解葡萄糖轉化率為考察指標，利用Design－Expert 8.0（DX8）軟件進行 Mixture實驗設計，設計纖維素酶、半纖維素酶與果膠酶添加方案，其實驗方案與結果見表2。

表2 Mixture設計實驗結果

2.7 回歸模型的建立

運用Design－Expert 8.0（DX8）軟件對數據進行分析，并進行擬合得到的方程式為：Y（%）＝0.78A＋0.63B＋0.018C＋0.69AB＋1.65AC＋0.68BC＋0.10AB（A－B）－2.43AC（A－C）－0.96BC（B－C），該模型的相關系數R2為0.9100，表明91.00%的實驗數據能符合這一模型的擬合。

表3 回歸模型顯著性檢驗

由表3可知，模型的F值為10.12，P值為0.0018，P≤0.01，說明該模型處于極顯著水平。同時，Adeq Precision信噪比為10.347，信噪比大于4是理想的［20］，表明該模型信號很強。綜上所述，該模型能很好地解釋響應值的變化，得到的回歸方程模擬三因素三水平的設計分析是可行的。

2.8 影響酶解轉化率的響應面分析

以酶解葡萄糖轉化率為響應指標值，對纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶3個因素進行響應面分析，對應的響應面圖譜和等高線圖見圖6和圖7。

圖6 纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶之間的交互作用的立體分析圖

圖7 纖維素酶、半纖維素酶與果膠酶之間的交互作用的等高線圖

由圖6和圖7可知3個因素之間的交互作用對酶解轉化率的影響。等高線呈現的圓形與橢圓形表示不同因素之間的交互作用的強弱［21，22］。由圖6和圖7可知，纖維素酶和半纖維素酶以及半纖維素酶和果膠酶之間存在一定交互作用，纖維素酶和果膠酶之間的交互作用極為顯著。

2.9 驗證實驗

利用 Design Expert 8.5Mixture設計給出的最優加酶方案為ctec2∶htec2為0.63∶0.37，按照推薦的加酶比例，在上述預處理條件下進行酶解驗證實驗，并設置原加酶比例（0.77∶0.23）為對照組，3次平行實驗得到的纖維素到葡萄糖的轉化率為89.73%，與理論預測值88.96%相比高 0.77%，相對誤差為0.87%＜10%，且明顯高于對照組82.64%的葡萄糖轉化率，且半纖維素到木糖的轉化率也有明顯提升，相對提升7.5%。結果表明采用Mixture設計優化的加酶方案準確可行。

3 結論

利用堿過氧化氫法對麥糟進行預處理能有效提高不同底物濃度下麥糟纖維素到葡萄糖以及半纖維素到木糖的轉化率。酶解時間24h，在較低底物濃度下（10%）酶解葡萄糖的轉化率可達到80%以上，高底物濃度下（25%）轉化率可達70%。在堿過氧化氫預處理基礎上進一步對麥糟進行水洗，能有效提高糖酶解轉化率。

本實驗確定了堿法預處理麥糟酶解轉化還原糖的工藝：預處理NaOH添加量0.08g/g底物，底物濃度25%，預處理后水洗，酶解時間24h，加酶比例ctec2∶htec2為0.63∶0.37。在該工藝條件下，纖維素到葡萄糖的轉化率與半纖維素到木糖的轉化率可分別達到89.73%，65.75%，較未預處理及優化前分別提升約45%，18%。在該工藝下對麥糟進行堿過氧化氫法預處理、水洗、酶解，能實現葡萄糖與木糖的高效轉化，這為啤酒工業合理利用麥糟提供了一條有效的途徑，也為利用生物質資源綠色生產葡萄糖與木糖等還原糖提供了一種合理的方式。