非小細胞肺癌患者中XAF1的表達及其臨床意義

王曉燕

(紹興市人民醫院腫瘤內科，浙江 紹興 312000)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，而非小細胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)是肺癌最常見的組織學類型，約占肺癌總數的80%～85%，約75%的患者發現時已處于中晚期。目前對于NSCLC患者的治療以手術聯合放療、化療和分子靶向治療的綜合治療為主，但5年生存率很低[1]。肺癌的發生過程尚不清楚，其中涉及不同基因水平的調控[2]。X染色體相關凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP)是一種凋亡抑制蛋白，而XIAP相關因子1(XIAP associated factor 1，XAF1)是新近發現的XIAP拮抗劑，可抑制XIAP的抗凋亡作用[3-4]。本研究擬探討NSCLC患者中XAF1的表達，分析XAF1基因的表達水平與臨床病理特征的關系，尋求治療NSCLC新的靶標。

1　資料和方法

1.1一般資料選擇2013年6月—2016年12月在我院進行手術治療的NSCLC患者60例，其中男34例，女26例，平均年齡41.9±6.5歲；均經X線、支氣管鏡、病理學等檢查確診為NSCLC，術前無放化療史，患者無手術禁忌癥且患者病例、臨床資料完整，患者均知情同意，并簽署知情同意書。收集60例NSCLC患者的癌組織標本及配對正常癌旁組織標本。

1.2研究方法采用Real-PCR檢測XAF1基因mRNA的表達。具體過程如下：采用TRIzol? Plus RNA Purification Kit(購自Thermo Fisher Scientific公司)抽提癌組織和癌旁組織的總RNA，經濃度及純度檢測后反轉成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈的合成根據TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix操作說明(北京全式金生物有限公司)。根據NCBI上XAF1基因的基因序列，采用Beacon designer設計XAF1基因Real-PCR引物，引物序列: XAF1F：5'-GGGGTACCAGATCTCCTCCCTC-3'； XAF1R：5'-GCTCGAGGTCTCCAGCTGCTTG-3'。擴增片段長度為108 bp,以GAPDH作為參考基因，引物序列：GAPDH-F: 5’-CGACGTAGTCTCATCTGACTT-3’, GAPDH-R: 5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTT GA-3’，片段長度為124 bp，引物均由上海美吉生物有限公司合成。Real-PCR 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix(購自北京全式金生物有限公司)，Real-PCR反應在ABI7500熒光定量PCR儀中進行，擴增程序為：95℃預變性2 min, 95℃10 s；56℃20 s；72℃30 s，35cycles，并進行溶解曲線的分析，程序為：60℃1 min; 95℃30 s。采用2法計算癌組織和癌旁組織XAF1基因的相對表達量，Ct= Ct(XAF1基因)- Ct(GAPDH基因)。

1.3 統計學處理以SPSS19.0 統計軟件進行分析，XAF1基因相對基因表達量用(x±s)表示，采用配對t檢驗分析癌組織和癌旁組織XAF1基因的表達差異；采用單因素方差檢驗分析不同臨床病理特征間XAF1基因的表達差異；P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

XAF1基因及GAPDH基因qPCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，條帶單一，且擴增片段長度與理論大小一致，電泳結果如圖1所示。Real-PCR反應的重現性及精密度良好，如圖2所示。癌組織XAF1基因的表達量(1.47±0.65)低于癌旁組織XAF1基因的表達量(2.36±0.89)，差異有統計學意義(t=6.418，P<0.0001)。癌組織XAF1mRNA水平在不同年齡、性別、組織學類型之間差異無統計學意義(P>0.05)，高中分化的癌組織XAF1mRNA水平顯著高于低分化的XAF1mRNA水平，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著TNM分期的增加，XAF1mRNA水平也明顯降低，同時，淋巴結轉移患者的XAF1mRNA水平顯著低于無淋巴結轉移者，差異均有統計學意義(P<0.05)；見表1。

a.XAF1基因

b.GAPDH基因圖1　qPCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2　XAF1基因(I)及GAPDH基因 (II) qPCR擴增曲線圖

臨床特征例數XAF1mRNA水平F/tP年齡(歲)>40281.34±0.56≤40321.59±0.611.6550.1035性別男341.51±0.35女261.49±0.280.24490.8074病理類型腺癌211.29±0.79鱗狀細胞癌391.42±0.560.6990.5084分化程度高中分化331.67±0.28低分化271.26±0.255.918<0.0001分期I171.59±0.34II281.21±0.18III90.76±0.23IV60.66±0.1235.25<0.0001淋巴結轉移有201.03±0.25無401.68±0.338.679<0.0001

3　討論

NSCLC是最常見的惡性腫瘤之一，隨著分子靶向治療技術和診斷技術的發展，NSCLC的治療效果得到了一定的提高，但患者5年生存率仍低于20%，復發和轉移率仍居高不下。目前關于NSCLC的發病機制并不清楚，探索NSCLC新的腫瘤靶分子一直以來備受關注。

人線粒體轉錄終止因子3蛋白、高遷移族蛋白B1、卵巢癌構域蛋白酶1等多種腫瘤靶分子被認為與NSCLC的發生密切相關[5-7]。XAF1基因是新近發現的一個XIAP拮抗蛋白，由301aa組成，其結構域中含有7個鋅指結構，位于染色體17p13.2位點，在抑癌基因P53的遠端3cm處。目前的研究指出，XAF1可誘導干擾素的表達，介導干擾素誘導的細胞凋亡，增強TRAIL誘導的腫瘤細胞凋亡；同時，XAF1可與XIAP結合并抑制XIAP的抗凋亡作用[8]。 XAF1基因的失活與黑色素瘤、結直腸癌、肝癌、胃腸癌的發生、發展密切相關，在多種癌組織中呈低表達水平，XAF1基因的失活也被認為與腫瘤細胞的耐藥性有關[9-11]。

本研究應用Real-time PCR研究XAF1基因在NSCLC患者癌組織和正常癌旁組織中的mRNA水平的表達情況，分析XAF1基因的表達水平與臨床病理特征的關系。結果顯示XAF1基因在NSCLC患者癌組織的表達水平明顯低于正常癌旁組織的表達量，這與原先報道的XAF1基因在黑色素瘤、結直腸癌、肝癌、胃腸癌的表達水平結果相似[9-10]。進一步的分析結果顯示高中分化的NSCLC癌組織XAF1mRNA水平顯著高于低分化的XAF1mRNA水平，隨著TNM分期的增加，NSCLC癌組織XAF1mRNA水平也明顯降低。同時，淋巴結轉移NSCLC癌組織患者的XAF1mRNA水平顯著低于無淋巴結轉移的NSCLC癌組織患者，該結果提示XAF1基因的低表達可能與促進NSCLC的發生、發展有關。目前的研究認為XAF1的抑癌機制可能是涉及到XAF1基因啟動子區域的CpG島甲基化機制、XAF1基因位點的雜合性缺失、調節細胞周期檢查點、介導干擾素誘導的細胞凋亡、競爭性抑制XIAP對Caspase-3抑制作用以激活Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性[12-13]。具體原因仍有待進一步研究。

綜上所述，XAF1基因在NSCLC患者中呈低水平表達，隨著分化程度降低、TNM分期增加及淋巴結轉移，XAF1基因的表達水平也逐漸降低。XAF1基因的低表達或缺失可能促進了NSCLC的發生、發展。