牛血清白蛋白調制下金納米片礦化

薛中會

(上海出版印刷高等?？茖W校 基礎部，上海 200093)

基于蛋白質和其它生物分子的分子仿生學(molecular biomimetics)是在分子水平上利用生物礦化原理對材料和體系的功能、結構的仿生合成[1].近年來，對脊椎動物的骨骼和牙齒[2]、軟體動物和甲殼類動物外殼[3，4]、單細胞生物硅藻[5]等的生物礦物形成過程的研究結果表明這些生物礦物材料都是在特定的蛋白質和/或其它生物大分子調控下的納米顆粒的分級有序組裝.受這個重要的生物體合成材料的啟發，人們從天然蛋白和人工合成的多肽中篩選出能夠控制和誘導無機顆粒生長的有用品種，進而利用它們研究對無機材料形貌、尺寸、晶型和取向的調控作用[6-8].

受生物體合成無機材料過程和原理的啟發，利用生物礦化原理在實驗室模擬合成無機納米顆粒成為材料學家研究的熱點領域.生物體合成材料具有幾個方面的優點：(1)常溫，常壓下合成；(2)中性酸堿度下合成；(3)利用材料和“試劑”無毒.這三個特點和現代材料綠色合成的三個標準非常適應.因此，根據上面的三個標準，利用微生物或生物分子合成納米粒子是一個理想的選擇[9，10].

金納米粒子由于其特殊的性質，在許多領域具有相當廣泛的應用，如在催化、生物傳感、生物標記和蛋白質的電泳分離等方面的應用.對微生物成礦的研究表明，某些細菌有對金離子富集，進而還原成單質金的能力，如Gridlock等報道的金生物礦化過程[10].目前，形狀可控的金納米粒子的合成一般采用光化學，溶液化學、生物化學和Langmuir單層膜的方法[8-11].在這些方法中，利用生物礦化原理在較為溫和的條件下合成形貌和尺寸均一的金納米粒子逐漸成為研究的熱點，如Yang等利用溶菌酶作為修飾劑在氯金酸和硼氫酸鈉溶液中也對形成的金納米粒子的單層包覆[12]；Nayak等利用賴氨酸實現了氯金酸的還原，并且賴氨酸包覆金納米粒子的表面[13]；Bai等利用1-hexadecyl-3-methylimidazolium bromide單層膜在氣-液界面合成了取向生長的金微米顆粒，這些研究對金納米粒子的仿生合成起到了重要的推動作用[14].然而，目前很少采用表征和分析較為完善和清楚的蛋白質單層膜控制金的仿生合成，本文利用BSA單層膜調制形成金納米粒子，獲得了較好的研究結果.

1　實驗部分

1.1　材料和方法

HAuCl4和BSA：美國Sigma Aldrich公司，使用時未經任何提純；使用三次蒸餾后的去離子水(Ultrapur e Millipore water，18.2 MΩ)作為溶劑，由于HAuCl4對鉑片具有較強的腐蝕作用，選擇和鉑片相同重量的濾紙作為膜片，測試表面壓.

參考文獻[15]配備BSA的水溶液作為成膜物質；配備0.0010 mM的HAuCl4水溶液作為亞相.把新配備的HAuCl4水溶液倒入清洗干凈的LB槽中，快速清理表面后用微量進樣器鋪上面配好的BSA的水溶液到HAuCl4液面上，保持穩定30 min后開始壓膜，到目標壓15 mN/m后保持不同的時間，最后把保持不同時間的樣品提摸到已處理過的玻璃片和銅網上.所有實驗在室溫下進行.

1.2　表征

JSM-5600掃描電子顯微鏡(SEM)，日本電子株式會社(JEOL Ltd.)；X’Pert Pro MPD X射線粉末衍射儀(XRD)，荷蘭Philips，Cu-Kα：0.15406 nm；JEOL-2010投射電子顯微鏡(HRTEM)測試，日本電子株式會社(JEOL Ltd.).

2　結果和討論

2.1　投射電子顯微鏡和高分辨結果

圖1a是在BSA膜界面反應不同時間得到的樣品的TEM圖.從圖1a可以看出，反應12 h得到了大量密集的納米顆粒，尺寸分析表明粒徑在2 nm左右的金納米顆粒.圖1a中右上角是納米顆粒對應的SAED圖，彌散的環表明形成的金納米顆粒為無定型態金.圖1b是反應24 h在膜界面得到的金顆粒的大范圍低放大倍數TEM圖，可以看出生成了大量的球形納米粒子，同時也觀察到了少量的三角形納米粒子.圖1c是反應24 h在膜界面得到的金顆粒的小范圍高放大倍數TEM圖.從圖中可以明顯地看出已經有三角形金粒子形成，尺寸在100 nm左右，同時也觀察到大量的尺寸在30 nm球形金納米粒子，而且球形金納米粒子是許多小的粒子聚集體，如圖1c中白色斷點圓包圍的區域.圖1c右上角的插圖是三角形金顆粒的SAED圖，明顯的規律分布的點陣衍射點表明三角形金納米是單晶結構.圖1d，e是當反應時間推進到36 h獲得樣品的TEM低倍圖和高倍圖，從圖1d可以看出三角形、切去尖端的三角形和六角型金納米粒子形成.圖1e的TEM高倍數的放大圖表明尺寸大約在500 nm左右，而且三角形的三個邊非常的粗糙；圖1e中的插圖是三角形對應的SAED，強而清晰的規律型衍射斑點表明所形成的三角形金納米粒子是單晶金.繼續延長反應時間到48 h，獲得更大的金納米粒子.圖1f是反應48 h得到的金納米粒子，從圖中可以看出形成的仍是三角形金粒子.仔細分析發現盡管三角形的尺寸沒有發生較大的變化，但是三角形的邊界已經變得不是那么粗糙，圖1f中的插圖是對應的SAED，更加清晰的衍射斑點說明金納米顆粒的晶化已經很好.TEM和對應的SAED表明BSA分子有能力控制BSA形成單晶結構，在不同的時間可以得到不同尺寸的單晶金納米粒子.圖2是圖1f對應的HRTEM圖，方向一致的晶格條紋進一步說明形成了單晶結構的金粒子.

圖1　BSA單層膜界面生長不同時間得到的金粒子的SEM和TEM圖，(a)12 h；(b,c)24 h；(d,e)36 h；(f)48 h.

2.2　XRD結果

TEM，SEM和SAED圖已經表明反應時間影響著金粒子的成核和生長.僅僅通過上面的結果，還不能表明我們得到的單晶金是歸屬于哪種晶型.XRD是表征晶體結構的非常有用的手段，借助于XRD我不但能夠辨別出晶體的相結構而且能從衍射峰的相對強弱的變化給出晶體生長的取向面.

圖2　三角形片狀金顆粒的HRTEM圖

圖3　不同時間樣品的XRD圖：(a)12 h；(b)24 h；(c)36 h；(d)48 h

圖3a，b，c和d分別表示BSA單層膜控制下金晶化12 h，24 h，36 h和48 h的XRD圖.圖3a表明沒有任何衍射峰出現，說明此時形成的金顆粒無定型納米粒子，和圖1a中的插圖SAED結果相對應.和12 h的結果相比，晶化24 h樣得到的金粒子的XRD只有一個衍射峰，衍射角為38.24°，通過和標準圖譜相對比，指認為面心立方晶型金的(111)晶面，JCPSD卡號為04-0784，單一衍射峰的出現可能是由于取向生長的結果，為此我們進一步考察了更長時間樣品的XRD圖譜；相比而言晶化36 h和48 h的金粒子的XRD衍射峰都出現兩個衍射峰，角度為38.24°和81.78°，分別對應于面心立方晶型金的(111)晶面和(222)晶面，由于(222)晶面是(111)晶面的次級衍射.(222)晶面的出現是由于金晶體更為完全的結構，這點和我們在圖1e和1f插圖中的SAED圖譜的強度逐漸增強相一致.結合XRD結果和SAED結果，可以看出在BSA單層膜控制下形成了呈現沿(111)晶面取向生長的面心立方的金單晶粒子.同時我們發現金粒子的晶型經歷了一個從無定型到晶態轉變的過程.這點和BSA單層作用下碳酸鈣的晶型轉變過程相類似，關于碳酸鈣從無定型到晶態的轉變過程我們在前幾章已做了詳細的說明，在此不做過多的解釋.總的來說，在BSA單層膜調制下，晶化的初始階段形成無定形的金粒子，隨著晶化時間的延長，無定型粒子逐漸轉變成單晶結構的金粒子，并沿(111)面取向生長.

結合SEM，TEM，SAED和XRD的結果，我們可以看出，BSA單層膜能控制金粒子的成核、尺寸、形貌和取向生長.但是BSA單層膜是如何實現這種控制作用？很明顯，通過金晶體生長的動態演變過程能夠完全解析BSA的作用的.因此在下面的討論部分，我們探索性地探討了BSA的作用和影響.

2.3　BSA單層膜和金粒子的分子識別

如上所述，分子識別機制主要的內容和生物礦化的一般原理相一致.但是問題的關鍵是我們實驗中用到的BSA和金粒子之間如何通過分子識別發生相互作用.結合以上的文獻報到和有關BSA的物理化學性質，我們對BSA和金粒子之間的分子識別機制做了一些探究.首先溶液中的氯金酸離子通過和BSA功能集團的相互作用還原出游離的單質金，該種還原作用一定和BSA分子中的某些具有還原功能的氨基酸殘基密切相關，如含—HS的殘基[16-21]等；而后游離的金單質形成團簇，進而進化成無定型態金粒子，BSA在次過程中起著穩定和組裝無定型相的作用，可能和BSA分子中存在的半胱氨酸殘基(BSA分子氨基酸序列中的第35個氨基酸殘基)相關，二者之間形成了Au—S形式鍵[22]；Xie等研究了BSA存在于四氯金酸溶液中時對金粒子的形貌的影響[20]，他們分析認為BSA中的某些氨基酸殘基對片狀結構金粒子的形成起著重要的作用.他們推測BSA分子中的天門冬氨酸殘基和谷氨酸殘基中的—COO-離子是形成片狀金粒子的基本離子.我們實驗研究的是蛋白質在膜界面時對金粒子的調控作用.二者之間可能存在形式上的差異，但是在分子相互作用上沒有差別，因為形式上的不同只能導致BSA分子物理狀態的不同，不會引起化學性質的變化，所以BSA分子和金粒子之間的化學作用沒有變化.

單層膜的對晶體的調控作用的一個重要特征就是能實現對晶體生長取向的控制.盡管Xie等人利用BSA實現對金粒子形貌和尺寸的調控[20]，他們忽略了對金粒子取向生長性的研究，同時他們采用的調控溫度較高(37-70 ℃之間).受BSA調控碳酸鈣取向生長的啟發[23，24]，我們對BSA作用下金粒子的取向生長做了分析討論.

圖4　推測的BSA單層膜和金(111)面的晶面匹配示意圖.(a)BSA在純水界面的模型；(b)金(111)晶面的示意圖；(c)BSA在四氯金酸亞相上的模型示意圖；(d)BSA二級結構和金(111)晶面的匹配圖

示意圖4a，b是BSA分子和面心立方晶體金(111)面二維點陣示意圖.由α-螺旋平行排列的BSA單層膜具有正交結構，晶胞參數為a=0.58和b=0.54 nm[25](圖4a)，分別對應于α-螺旋鏈間距和螺距；圖4b是金的(111)晶面示意圖，具有參數為a1=b1=0.29 nm，θ=120°菱形結構.研究表明BSA的螺旋結構是平行與界面的有規律擺列，即由螺旋形成的a-b面是平行于膜界面的.因此結合第三章碳酸鈣和BSA螺旋結構的晶面匹配關系，我們推測BSA螺旋結構形成的ab面有可能和Au的ab面在結構上存在晶面面匹配現象[26].

然而，從表面上來看，BSA由α-螺旋二級結構形成的a-b面和有金的(111)面中的Au形成的a-b面的晶胞參數上不存在匹配關系.但是我們必須注意到三個方面：(1)無論有機模板還是無機材料在膜界面的礦化結晶過程，它們都不是剛性的二者都會通過結構的重排相互適應，達到良好的匹配效果[27]；(2)研究表明有機模板的柔性和無機粒子初期的無定形態的可塑性是二者重排的關鍵因素[28-31]；(3)文獻報到表明在結構失配度30%以內晶體和有機模板都可以通過結構重排來時先匹配[31，32].通過模板柔韌性的調整和結構調整，二者之間相互適應，到達如圖4c，d所示匹配關系.具體如下：BSA由α-螺旋二級結構形成的ab面和有金的(111)面中的Au形成的ab面的晶胞參數存在如下關系：a=2a1和b≈1.73b1，失配度為8%遠遠小于最大失配度30%，文獻報道在達到30%失配仍可相互適應而匹配[32].

2.4　BSA單層膜調制下金粒子的成核和晶化機制

經典結晶理論表明，成核和生長是晶體形成的兩個關鍵步驟.溶液中的成核物種通過聚集形成較大的團簇，長時間穩定的團簇達到臨界成核程度后，晶體開始成核；而后新晶核形成后，溶液中的離子或分子不斷地吸附到晶核表面，晶核逐漸長大，形成晶體，這就是晶體的生長過程.在我們研究的BSA單層膜調制下的晶化實驗中，SAED圖和XRD衍射圖表明金晶體粒子的是通過無定形態的金粒子轉變形成的，不是經典的生長過程.大量的研究也表明，生物礦化和模擬生物礦化下的碳酸鈣、磷酸鈣晶化過程是一個不同于經典結晶理論描述的結晶過程.一般先在大分子的作用下形成無定型礦物，而后無定型礦物經歷溶解和再結晶過程轉變成晶態礦物.結合生物礦化的非經典結晶機制和我們的實驗結果，我們推測BSA單層膜作用下金晶體粒子的成核和生長過程如圖5所示.首先溶液中的金粒子被BSA分子還原出來，由于金粒子帶正點，通過電荷吸引的作用溶液中被還原的金吸附到BSA單層膜界面，形成無定形態的金納米聚集體，圖5a，b所示；隨著反應的深入，無定型納米金團簇轉變成片狀的金晶態粒子；隨著反應的繼續進行，片狀的金晶體粒子不斷地吸附無定型金納米粒子到三角形片狀結構的邊上，金晶體逐漸變大，如圖5c和d所示.無定型態金粒子吸附到三角形邊界的現象可以從圖1c，e和f中三角形片狀金粒子的粗糙邊界和邊界上的納米聚集體得到很好的證明，如圖1c，e和f中的白色箭頭所示.隨著反應時間的繼續延長，晶體生長速度變慢，這可能是由于溶液中晶化物種的逐漸耗盡所致，從圖1f周圍納米粒子的減少中得到印證，從上面的討論可以看出溶液中的金在BSA的調控下經歷一個從無定形-聚集體-晶化-長大的過程，簡單來講就是從不穩定態到穩定態，從小粒子到大粒子的成核、晶化和生長的過程.這也和Ostward-Lussac定律相一致，Ostward等認為晶體的生長是從不穩定態到穩定態的逐漸轉變過程，粒子的變大來源于較小粒子因為具有較大的表面能，所以也不穩定，易于被吸附到角的粒子的表面，使得較大可以變得更大，較小顆粒逐漸減少[33，34]，也即是大家通常認為的“大魚吃小魚”現象.我們研究表明金在蛋白質作用下從離子元素到固態單質晶體的晶化過程和蛋白質調制作用下的碳酸鈣的礦化過程非常相似.或許我們可以這樣推測細菌微生物富集和還原金離子或許也經歷里了相似的過程[35，36].因此該研究不但對于理解蛋白質作用下的礦化機制有重要的作用，而且對于利用蛋白質富集微量貴金屬的生物選礦過程有重要的潛在的應用價值.

圖5　BSA單層膜作用下金粒子成核和生長的可能過程

3　結　論

通過簡單的模擬生物礦化方法，在室溫沒有添加任何還原劑的條件下仿生合成了三角形片狀結構面心立方晶系的單晶金納米粒子.研究結果表明BSA單層膜作為一種多功能生物大分子單層膜.相對短的反應時間有利于形成無定型態金粒子，較長的反應時間易于形成單晶結構取向生長的金粒子.研究能為綠色條件下合成具有特定功能和應用潛力的納米材料提供幫助和借鑒.另外，該研究能為利用生物分子對礦物的特定作用進行生物選礦提供借鑒.