中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型蛋雞育雛育成期免疫功能的影響

劉曉婷，羅 燕，陳 潔，連科訊，劉 鋼，馬 昭，朱曉慶，谷新利

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】在畜禽生產(chǎn)中使用免疫增強劑可增強動物機體的免疫應(yīng)答，輔助疫苗發(fā)揮良好防疫效果。中藥多糖是從中草藥中提取出的具有增強免疫、抗炎、抗病毒、抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)造血功能等多種生物活性作用的成分之一，它毒副作用小，體內(nèi)殘留量低，具有開發(fā)成療效確定、性質(zhì)穩(wěn)定、毒副作用小的免疫增強劑的前景[1]。【前人研究進展】研究表明，中藥多糖可以通過提高免疫器官指數(shù)、促進淋巴細胞增殖，影響細胞因子的生成與分泌，促進抗體的產(chǎn)生等途徑來提高動物機體的免疫力[2,3]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，多糖類物質(zhì)是T細胞依賴性抗原之一，可以通過胞吞途徑，被MHC II類分子處理、呈遞，最終被TCR識別，參與機體細胞的免疫，誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生[4]。【本研究切入點】經(jīng)合理配伍組成的中藥復(fù)方，其免疫增強效果在一定程度上優(yōu)于原有的單味中藥[5]。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是動物抗病育種的主要候選基因群之一，而具有豐富多態(tài)性的雞MHC B-Lβ II基因的遺傳變異與機體免疫性狀有著顯著的關(guān)聯(lián)性，表現(xiàn)出不同個體間免疫功能存在強弱的差異[6,7]。研究中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-Lβ II基因型蛋雞育雛育成期免疫功能的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】試驗排除因MHC B-Lβ II基因多態(tài)性而導(dǎo)致的不同基因型個體免疫能力的差異，研究中藥復(fù)方多糖對蛋雞臟器指數(shù)、血常規(guī)部分指標、GM-CSF和G-CSF質(zhì)量濃度的影響，篩選出其對各基因型雞的最佳免疫劑量，為中藥復(fù)方多糖在臨床的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物

中藥復(fù)方多糖由石河子大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)研究室提供。復(fù)方由當歸、黨參、川芎、黃芪、熟地、淫羊藿、山楂、茯苓、何首烏、補骨脂與麥冬等11味中藥按一定配比組成，復(fù)方多糖濃度為77.10%，用等量滅菌超純水稀釋，將中藥復(fù)方多糖配置成50(高劑量)、25(中劑量)和12.5 mg/mL(低劑量)3個質(zhì)量濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

動物血細胞分析儀應(yīng)用試劑購自深圳普康電子有限公司；雞GM-CSF、G-CSF ELISA檢測試劑盒均購自上海藍基生物有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(La Sota 株+H120株)及雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)均購自哈藥集團生物疫苗有限公司；雞新城疫病毒(La Sota株)、傳染性支氣管炎病毒(M41株)二聯(lián)滅活疫苗，購自普萊柯生物工程股份有限公司；禽流感二價滅活疫苗(H5N1 Re-6株+H9N2 Re-2株)購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 方 法

1.2.1 PCR-SSCP基因型檢測

1.2.1.1 基因組DNA的提取

翅下靜脈采血0.2 mL/羽，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20℃冷凍保存。用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(NO.M29763.1)，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計引物，引物序列為：上游引物：5‘-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3’，下游引物：5‘-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3’，擴增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.1.3 PCR擴增

PCR擴增體系20 μL：2×PCR Mix 10 μL，模版DNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94變性40 s，60.5℃退火45 s，72℃延伸35 s，32個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物由2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.1.4 PCR-SSCP分析及序列測定

取3 μL PCR產(chǎn)物加7 μL 變性上樣緩沖液，98℃變性10 min，變性結(jié)束后迅速置于冰上冰浴10 min。用8%聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Scr=29∶1)電泳檢測，300 V電壓預(yù)電泳10 min，120 V電泳16 h后，固定、銀染、顯色，判定基因型，拍照保存。各取3個不同基因型個體的PCR產(chǎn)物進行純化回收，送華大基因科技股份有限公司進行測序，對PCR-SSCP分型結(jié)果進一步驗證。

1.2.2 分組

500羽1日齡京粉1號蛋雞，購自新疆昌吉某一孵化場提供，根據(jù)MHC B-Lβ II基因第3外顯子PCR-SSCP的檢測結(jié)果分組，再將各組分為高、中、低劑量中藥多糖組和空白對照組。分別于8日齡肌肉注射50、25、12.5 mg/mL中藥復(fù)方多糖和生理鹽水，每只0.2 mL，連續(xù)注射7 d。

所用試驗雞1日齡馬立克疫苗噴霧免疫(于孵化場進行)，7日齡新、傳二聯(lián)活疫苗點眼免疫，21日齡新、傳二聯(lián)活疫苗點眼與新、傳二聯(lián)滅活苗肌注免疫，14日齡法氏囊疫苗滴口免疫，28日齡禽流感二聯(lián)滅活苗免疫。在相同條件下常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件、營養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理均一致，飼養(yǎng)期為7周，整個試驗期雞群健康狀況良好。

1.2.3 檢測項目

1.2.3.1 免疫器官指數(shù)

各組雞分別于21、35、49日齡隨機抽取5只，稱重后頸靜脈放血致死，迅速切開頸部和腹腔，完整分離并摘取胸腺、脾臟和法氏囊，剔除筋膜和脂肪組織，用濾紙吸干血水后準確稱重。免疫器官指數(shù)計算公式如下：

免疫器官指數(shù)=器官重量(g)/活體重(kg)×100%。

1.2.3.2 血常規(guī)

每組隨機抽取5只試驗雞，21、35、49日齡翅下靜脈采集EDTA抗凝血3 mL，用動物血細胞分析儀進行血常規(guī)分析，主要分析白細胞總數(shù)(WBC)、淋巴細胞(LYM)、中性粒細胞(GRA)、紅細胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板總數(shù)(PLT)。

1.2.3.3 血清GM-CSF、G-CSF質(zhì)量濃度的測定

每組隨機抽取5只試驗雞，于21、35、49日齡翅下靜脈采集非抗凝血3 mL，37℃靜置1 h，分離血清，測血清中GM-CSF、G-CSF的質(zhì)量濃度(均嚴格按照試劑盒說明書進行操作)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)以“x±SD”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

用所設(shè)計的引物對基因組DNA進行擴增，取所得PCR產(chǎn)物5 μL于2 %瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，研究表明，所設(shè)計引物的擴增結(jié)果較好，片段長度與預(yù)期大小一致，條帶清晰、無非特異性條帶，可直接進行SSCP分析。圖1

2.2 SSCP檢測

對所有DNA樣本的PCR產(chǎn)物進行SSCP多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)所擴增片段有3種基因型，分別定義為AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)。圖2

M，Trans DNA Marker I ；1～7，MHC B-Lβ II PCR擴增產(chǎn)物

M, Trans DNA Marker I; 1-7, PCR products of MHC B-Lβ II

圖1 MHC B-LβⅡ的PCR擴增結(jié)果
Fig.1 The PCR amplification results of MHC B-Lβ II

1、6、8、10：BC型；2、4、7、9：BB型；3、5：AA型

1、6、8、10:BCgenotype; 2、4、7、9:BBgenotype; 3、5;AAgenotype

圖2 部分試驗雞MHC B-LβⅡ基因型的PCR-SSCP檢測
Fig.2 PCR-SSCP detection of MHC B-LβⅡ genotype in partial hen

2.3 中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型蛋雞免疫器官指數(shù)的影響

研究表明，與空白對照組相比，21日齡，高劑量中藥復(fù)方多糖可顯著提高AA基因型和BC基因型雞的脾臟、法氏囊指數(shù)(P<0.05)；中劑量中藥復(fù)方多糖可顯著提高AA基因型雞的脾臟指數(shù)和BC基因型雞的法氏囊指數(shù)(P<0.05)；35日齡，高劑量中藥復(fù)方多糖可顯著提高AA基因型雞的法氏囊指數(shù)與BC基因型雞的胸腺指數(shù)，中劑量多糖可顯著提高AA基因型雞的胸腺、法氏囊指數(shù)及BC基因型雞的胸腺指數(shù)(P<0.05)；45日齡，中劑量復(fù)方多糖可顯著提高AA基因型雞的胸腺指數(shù)(P<0.05)。 各日齡高、中、低劑量復(fù)方多糖對BB基因型雞的胸腺、脾臟、法氏囊指數(shù)均有提高的作用，但均無顯著性差異(P>0.05)。表1

2.4 中藥復(fù)方多糖對不同基因型蛋雞血常規(guī)指標的影響

2.4.1 中藥復(fù)方多糖對不同基因型蛋雞白細胞的影響

研究表明，35日齡，AA基因型雞低劑量和中劑量中藥復(fù)方多糖組中白細胞總數(shù)與淋巴細胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，而中性粒細胞數(shù)高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)，BC基因型雞中劑量和高劑量中藥復(fù)方多糖組中白細胞總數(shù)與淋巴細胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，而中性粒細胞數(shù)高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；49日齡，AA基因型雞低劑量多糖組中白細胞總數(shù)和中性粒細胞顯著高于對照組(P<0.05)，中劑量中藥復(fù)方多糖組中白細胞總數(shù)和淋巴細胞顯著高于對照組(P<0.05)，BC基因型雞中劑量中藥復(fù)方多糖組白細胞總數(shù)與淋巴細胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，高劑量中藥復(fù)方多糖組淋巴細胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)。表2

2.4.2 中藥復(fù)方多糖對不同基因型蛋雞紅細胞與血小板的影響

研究表明，與對照組相比，各劑量中藥復(fù)方多糖對不同基因型蛋雞血常規(guī)中紅細胞數(shù)、血紅蛋白有一定程度的提高，但均無顯著性差異(P>0.05)。除49日齡，AA基因型雞高劑量多糖組中血小板總數(shù)顯著低于對照組外，21日齡、35日齡和49日齡，各基因型不同劑量多糖組與多對照組中血小板總數(shù)相比無顯著性差異(P>0.05)。表3

2.5 中藥復(fù)方多糖對不同基因型蛋雞血清的GM-CSF和G-CSF質(zhì)量濃度的影響

研究表明，隨著日齡的增加，不同基因型蛋雞血清中GM-CSF的質(zhì)量濃度呈遞減的趨勢，與對照組相比，21日齡時，各劑量中藥復(fù)方多糖對不同基因型蛋雞血清中GM-CSF的質(zhì)量濃度均有一定提高，但無顯著性差異(P>0.05)；35日齡時，中劑量中藥復(fù)方多糖可顯著提高AA基因型蛋雞血清中GM-CSF的質(zhì)量濃度(P<0.05)，高劑量中藥復(fù)方多糖可顯著提高BB基因型蛋雞血清中GM-CSF的質(zhì)量濃度(P<0.05)。G-CSF的質(zhì)量濃度，除在35日齡時BB基因型高劑量多糖組蛋雞血清中G-CSF的質(zhì)量濃度顯著低于BB基因型低劑量多糖組與空白對照組外(P<0.05)，其余日齡各組間并無明顯差異。表4

表4 不同基因型蛋雞血清的GM-CSF和G-CSF質(zhì)量濃度
Table 4 The mass concentrations of GM-CSF and G-CSF in serum of different genotypes of laying hens (pg/mL)

組別GroupsGM-CSFG-CSF21 d35 d49 d21 d35 d49 dAA-L AA genotype-Low-dose groupe34.66±2.5424.47±1.98b20.19±2.0845.61±4.3638.90±3.1340.65±4.19AA-M AA genotype-Middle-dose groupe37.83±2.7735.62±2.16a23.30±1.7440.15±2.1939.87±5.5643.96±3.97AA-H AA genotype-High-dose groupe36.91±2.9832.30±2.72ab27.70±1.5143.84±3.2737.53±3.2439.90±3.58AA-C AA genotype-Conteol groupe33.26±2.5321.89±1.49b23.32±1.1942.89±3.7541.56±4.6741.67±3.96BB-L BB genotype-Low-dose groupe42.23±3.2728.42±2.33ab22.20±1.6451.30±5.3956.90±5.57a47.43±5.39BB-M BB genotype-Middle-dose groupe39.85±3.6826.20±2.53b29.86±2.3146.57±4.5848.40±4.28ab47.15±5.72BB-H BB genotype-High-dose groupe41.70±4.6239.81±2.87a27.47±2.4944.09±4.3742.68±3.62b48.76±4.73BB-C BB genotype-Conteol groupe31.63±2.7327.64±2.57b27.30±1.8846.52±2.9754.24±4.69a51.17±5.98BC-L BC genotype-Low-dose groupe41.11±2.6931.51±2.4220.44±1.0447.88±4.2645.92±3.3749.41±5.44BC-M BC genotype-Middle-dose groupe38.23±2.0735.95±2.8128.91±2.5343.80±4.4245.80±3.3647.03±4.87BC-H BC genotype-High-dose groupe39.27±3.4836.80±2.1724.22±1.2947.24±5.1342.52±4.9347.44±4.82BC-C BC genotype-Conteol groupe34.46±2.4730.94±2.3128.73±1.4745.55±4.8343.81±4.7746.18±4.29

3 討 論

胸腺是T淋巴細胞分化、發(fā)育、成熟的場所，它具有調(diào)節(jié)機體免疫功能和增強機體抗腫瘤、抗感染的能力。法氏囊為禽類特有的產(chǎn)生B淋巴細胞的中樞免疫器官，其功能與體液免疫相關(guān)。脾臟是機體最大的免疫器官，含有大量的T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。免疫器官發(fā)育的水平直接影響機體的免疫調(diào)節(jié)功能和對疾病的抵抗力，免疫器官指數(shù)在一定程度上能反映免疫器官的發(fā)育水平，從而反映機體的免疫狀態(tài)。有試驗表明，中藥多糖可以促進免疫器官的發(fā)育，提高動物的免疫器官指數(shù)。羅李媛[8]在給雞飼喂川牛膝多糖后，發(fā)現(xiàn)胸腺、脾臟以及法氏囊臟器指數(shù)均有所提高，且以早期階段使用川牛膝多糖提高雞體的免疫功能的效果最為顯著。石念進等[9]通過對黃芪多糖、復(fù)方多糖的比較發(fā)現(xiàn)，提取的復(fù)方中藥多糖有促進雛雞免疫器官發(fā)育的作用，且效果良好。研究結(jié)果顯示，給予試驗雞中藥復(fù)方多糖后的不同時間，高、中、低劑量中藥復(fù)方多糖均能顯著提高雞胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)，并且中劑量和高劑量中藥復(fù)方多糖組的免疫器官臟器指數(shù)均高于低劑量中藥復(fù)方多糖組，中、高劑量多糖能夠更有效促進免疫器官的生長發(fā)育與成熟，增強蛋雞的細胞免疫與體液免疫，抵抗各種病原微生物感染的能力提高。

血常規(guī)檢查是動物疾病診斷的重要輔助方法，同時也反映動物機體造血與免疫機能的狀況。血細胞常分為白細胞、紅細胞和血小板三大類，其分類計數(shù)結(jié)果可以反映動物機體的生理狀態(tài)。白細胞是機體抵御病原微生物等異物入侵的主要防線，具有吞噬、產(chǎn)生抗體、傳遞免疫信息等功能，在正常生理狀態(tài)下，白細胞總數(shù)反映機體的綜合的免疫反應(yīng)能力，其變化可以反映機體的抵抗力[10]。紅細胞的主要功能是運輸O2和CO2，且對酸、堿物質(zhì)有緩沖作用，且主要依賴于紅細胞內(nèi)的血紅蛋白來實現(xiàn)這些功能。血小板是由骨髓成熟的巨噬細胞胞漿裂解脫落下來的具有生物活性的小塊胞質(zhì)，在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)等生理和病理過程中有重要保護作用[11]。聶健等[12]對免疫抑制小鼠給予當歸補血湯處理后，可明顯提高造模小鼠的白細胞、紅細胞生成，提高血紅蛋白含量，且對脾臟萎縮有明顯的拮抗作用。王宏軍等[13]研究表明，南五味子多糖粗品可提高雛雞的胸腺、法氏囊、脾臟免疫器官指數(shù)，增加雛雞外周血紅細胞總數(shù)、白細胞總數(shù)及淋巴細胞、單核細胞含量，對機體發(fā)揮非特異性免疫起到積極的作用。試驗結(jié)果顯示，各基因型高、中、低劑量的中藥復(fù)方多糖組的白細胞總數(shù)和淋巴細胞數(shù)均高于對照組，這進一步顯示了該中藥復(fù)方多糖能夠提高機體的免疫能力。

GM-CSF是一種多潛能性細胞因子，在對骨髓造血細胞的調(diào)控和機體免疫調(diào)節(jié)中均發(fā)揮著重要作用[14]。G-CSF是粒細胞的重要調(diào)節(jié)因子，作用于骨髓粒系祖細胞，刺激造血干細胞的增殖、分化與成熟，增加外周血中性粒細胞的吞噬活性及趨化性，從而促進機體免疫力[15]。部分中藥多糖能夠調(diào)節(jié)GM-CSF、G-CSF的產(chǎn)生和分泌，從而具有增強造血機能、升高白細胞的作用[16]。田維毅等[17]研究發(fā)現(xiàn)黃芪、枸杞、地黃等3味中藥多糖組分一定濃度組小鼠血清 GM-CSF較空白對照組顯著升高，且具有濃度差異性。李興玉等[18]用巴西蘑菇多糖誘導(dǎo)人臍血單核細胞，發(fā)現(xiàn)其可促進造血干、祖細胞生成和人臍血單核細胞 GM-CFS 基因的表達。嚴善福等[19]增加牛膝多糖濃度可提高對粒系造血干細胞的動員作用，其與G-CSF具有協(xié)同加強作用，共同促進粒系造血干細胞增殖分化。試驗結(jié)果顯示，各劑量中藥復(fù)方多糖有提高不同基因型蛋雞血清中GM-CSF質(zhì)量濃度的影響，與田維毅等研究相似。

MHC是一個與機體的免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的多基因家族，不同個體間由于MHC基因的多樣性而導(dǎo)致免疫功能存在個體或品種上的差異。李福傳等[20]通過對3個地方品種的不同類型免疫滴度等免疫性狀的測定及與基因變異的關(guān)聯(lián)分析，表明不同免疫能力存在個體甚至品種水平上的遺傳差異，且不同免疫性狀存在顯著的優(yōu)勢基因型。吳春梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)北京油雞MHC B-F區(qū)基因的Exon 2 多態(tài)性高于來航蛋雞，且其異嗜性粒細胞數(shù)、H/L 顯著低于來航蛋雞，而白細胞總數(shù)、淋巴細胞數(shù)顯著高于來航蛋雞，產(chǎn)生免疫反應(yīng)比來航蛋雞快。在試驗的空白組中，AA基因型和BB基因型蛋雞的胸腺指數(shù)、白細胞總數(shù)、淋巴細胞數(shù)及血小板總數(shù)明顯高于BC基因型，表明AA基因型和BB基因型蛋雞的細胞免疫優(yōu)于BC基因型，但具體情況還需要進一步驗證。目前已有多種多糖被證實可作為T細胞依賴性抗原，由MHC II類分子處理與呈遞而被TCR分子識別。Cobb B. A等研究發(fā)現(xiàn)多糖能夠以糖蛋白、糖連接或通過胞吞途徑被NO系統(tǒng)降解為小分子量碳水化合物的方式，被MHC classⅡ類分子處理與呈遞而被TCR分子識別，進而活化T細胞誘導(dǎo)一定的免疫反應(yīng)[4,22]。在試驗的中藥復(fù)方多糖組中，高、中、低劑量多糖對不同基因型蛋雞免疫器官、血常規(guī)部分指標及GM-CSF質(zhì)量濃度均有一定影響，但各劑量多糖對各基因型同一指標的影響并不相同，這可能與不同MHC B-Lβ II基因型雞機體的免疫系統(tǒng)對中藥多糖類外來抗原的敏感度及遞呈能力不同有關(guān)。MHC II基因多態(tài)性的存在可能會影響細胞上MHC II類分子的抗原結(jié)合槽結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得MHC 等位基因編碼分子和多糖的糖蛋白、糖連接及小分子量碳水化合物的結(jié)合產(chǎn)生一定的選擇性，而這一選擇性可能導(dǎo)致不同MHC B-Lβ II基因型個體對同一抗原的免疫應(yīng)答有所差異，進而導(dǎo)致各劑量多糖對各基因型同一指標影響的差異[23]。

4 結(jié) 論

MHC B-Lβ II基因的多態(tài)性使蛋雞的免疫能力存有個體差異，通過高、中、低三個劑量中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-Lβ II基因型京紅1號蛋雞免疫器官指數(shù)及血常規(guī)部分指標影響的比較分析，初步說明連續(xù)肌注7 d不同劑量的中藥復(fù)方多糖可以不同程度提高各基因型組蛋雞免疫器官指數(shù)、部分血常規(guī)指數(shù)及GM-CSF質(zhì)量濃度，且整體上以高、中劑量中藥復(fù)方多糖免疫效果更好。

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