獨行菜抗冷相關基因的克隆及表達分析

張 娜，胡 昕，傅代輝，丁金鵬，李 群

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】低溫是限制植物生長發育、地域分布、作物品質及產量的主要因素之一，常造成植物細胞膜流動性下降、酶活性降低、產生活性氧等，抑制植物的正常生長發育[1]。為降低傷害，植物從感知低溫信號到產生抗性之間存在一個復雜的信號傳導網絡系統。其中，CBF(C-repeat binding factor)轉錄調控因子的信號傳導途徑是主要的傳導系統之一，CBFs特異地與下游功能基因啟動子區域的順式作用元件DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat element，A/GCCGAC)結合，從而激活COR(Cold-responsive genes)等一系列低溫響應基因的表達，提高植株抗冷性[2]。對CBF為樞紐的調控網絡及抗冷機理的研究不僅有助于了解植物的抗冷機制，還可為作物抗冷品種的選育及改良提供理論依據。【前人研究進展】1970年，Weiser提出植物在適應低溫脅迫過程中激活特異基因的轉錄并合成新的蛋白質[3]。1985年，Guy等研究發現低溫和短日照處理能誘導和增強部分基因的表達，提高植物的抗寒性，將其稱為低溫響應基因[4]。Thomashow等從擬南芥中克隆出3個低溫響應基因cor6.6、cor47、cor15a[5]。其中cor15a基因編碼分子量為15kD的多肽，在葉綠體基質片層中被加工成為成熟的9.4kD的多肽，稱之為CORl5am[6]。Nancy等構建組成型表達CORl5am多肽的轉基因植物擬南芥，與野生型相比轉基因擬南芥中葉綠體和原生質體的耐低溫性以及原生質膜的穩定性有所提高，降低了低溫所造成的損傷[7]。1997年Stockinger在研究擬南芥低溫響應基因中發現CBF基因并命名為CBF1/DREB1b(C-repeat binding factor1/ dehydration -responsive element binding 1b)[8]。之后10年中以CBF為樞紐的信號途徑中的關鍵基因陸續被克隆，同時發現該途徑介導的低溫抗性機制在植物中普遍存在。CBF途徑是植物冷馴化過程中重要的信號傳導途徑之一，其核心是ICE-CBF-COR的調控。植物在正常生長環境中，ICE(induction of CBF expression region)處于非活化狀態，一旦植株受低溫脅迫時，ICE被迅速激活并與CBF啟動子中相關順式作用元件特異識別并結合，啟動CBF基因表達，進一步誘導其下游功能基因的表達，提高植物的抗寒性[9]。在擬南芥中，CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C、CBF3/DREB1A、CBF4這四個基因分別編碼CBF轉錄因子，其中，CBF1、CBF2、CBF3能被低溫迅速誘導表達做出響應，而CBF4則受干旱誘導，在低溫條件下變化不明顯[10]。研究發現CBF1、CBF3基因的過表達能大大提高植物的抗寒能力，其中CBF3的作用更強[11]。COR作為CBF轉錄因子的下游靶基因參與低溫響應信號通路[12]。目前，已從油菜(Brassicanapus)[13]、苜蓿(Medicagofalcate)[14]、菠菜(Spinaciaoleracea)[15]、薺菜(Capsellabursa-pastoris)[16]、大麥(Hordeunvulgare)[17]、小麥(Triticumaestivum)[18]等植物中克隆出低溫響應基因。ICE-CBF-COR信號通路的發現和闡明對于提高植物的抗寒性具有重要的指導意義。【本研究切入點】獨行菜(LepidiumapetalumWilld.)是十字花科獨行菜屬一年生草本植物，生長周期較短，常于早春時節萌發生長，種子萌發階段和幼苗生長對低溫脅迫具有一定的耐受性[19]。研究通過克隆獨行菜抗冷信號傳導途徑中的關鍵基因并進一步進行功能分析，為探討獨行菜抗冷性的分子機制提供線索。【擬解決的關鍵問題】克隆獲得獨行菜抗冷途徑中的關鍵基因LaCBF3、LaCOR15a的核心片段，利用半定量RT-PCR方法分析其在不同脅迫處理條件下的表達情況，對其在獨行菜低溫抗性中的作用進行初步分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

獨行菜種子于2016年6月采自新疆大學校園內。供試種子成熟、飽滿、顆粒均勻。自然環境下干燥后儲存于4℃冰箱。

在超凈工作臺內對獨行菜種子進行表面滅菌(70%乙醇30s，0.5%NaClO 20 min，無菌水沖洗3次)后布于1/2MS培養基，于生長室進行培養，生長室培養條件為16 h/25℃光照，8 h/20℃黑暗。

1.2 方 法

1.2.1 脅迫處理

獨行菜種子萌發生長兩周后將幼苗分別轉至含有100 μmol/L ABA、2% NaCl、20% PEG6000的1/2MS培養基及置于4℃低溫培養箱中進行脅迫處理，在脅迫處理0、0.5、2、8、12和24 h時收集葉片于液氮中迅速低溫凍后置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成

取上述1.2.1處理的材料各0.1 g，使用BioTeke通用植物總RNA提取試劑盒(RP3302)進行總RNA的提取。用DNaseI純化RNA以消除DNA污染，通過NANODROP微量核酸定量分析儀測定RNA的濃度、吸光度比值(A260/280、A260/230)，以及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的樣品RNA質量。

使用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(RR037A)進行cDNA的合成， 以EF-1a作為內參基因，反應體系為：5×PrimeScript Buffer 4 μL；PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL； Oligo dT Primer(50 μM)1 μL；Total RNA 1.5 μg/μL RNase Free dH2O up to 20 μL。反轉錄反應程序為：37℃ 15 min；85℃ 5 s；4℃ 30 min。

1.2.3 LaCBF3、LaCOR15a基因的克隆

從Genebank獲得十字花科植物(擬南芥、歐洲油菜、播娘蒿和薺菜等)已有的CBF3、COR15a基因的CDS序列進行同源比對，在其保守區遵循引物設計原則，利用 Primer Premier 5.0及DNAMAN7軟件設計引物，華大基因公司進行引物合成。以1.2.2獲得的獨行菜葉片cDNA為模板進行PCR擴增，反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切膠回收目的條帶后與pMD19-T載體連接，通過熱激法轉入E.coliDH5α感受態細胞，篩選獲得陽性克隆后將其菌液送至新疆昆泰銳生物有限公司測序，DNAMAN7軟件分析序列同源性。

1.2.4 半定量RT-PCR

對1.2.2獲得的獨行菜葉片cDNA為模板進行LaCBF3、LaCOR15a基因的半定量RT-PCR分析。總體系為20 μL，包括10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)(20 mM)0.1 μL；2.5 mM dNTP Mixture 1.6 μL，Template 0.5 μL上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O up to 20 μL。反應程序同步驟1.2.3。以EF-1a作為內參基因。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下進行檢測。表1

表1 引物序列
Table 1 Primer sequence

引物名稱引物序列LaCOR15aFLaCOR15aPLaCBF3FLaCBF3PEF-1aFEF-1aP5’-KGGCGATGTCTTTMTCMGGAG-3’5’-CATYCTTAGCCTCTYCWGC-3’5’- AAGAAACCRGCGGGTCGT -3’5’- CAWYAAMCTCGGCATSYC -3’5’- ATCCGGTGGTATTGGAACG-3’5’-GGGTCCTTCTTGTCAACGC-3’

2 結果與分析

2.1 獨行菜總RNA的提取

獨行菜總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到清晰的28S rRNA與18S rRNA兩條帶，無拖尾現象。A260/230 >2.00，A260/280=1.85～2.05，蛋白質、多糖等污染較少。圖1

2.2 LaCBF3、 LaCOR15a核心片段的克隆及菌液PCR鑒定

以低溫處理后的獨行菜幼苗葉片cDNA為模板，設計并合成兼并引物，經PCR擴增，獲得大小約為400 bp的兩條特異條帶。將該條帶切膠回收、連接、轉化、培養后各隨機挑取3個單克隆菌落進行菌液PCR檢測，將鑒定的陽性克隆菌液送至新疆昆泰銳生物有限公司測序，分別獲得442 bpLaCBF3及405 bpLaCOR15a的目的片段。利用DNAMAN 7軟件對獨行菜LaCBF3及LaCOR15a基因序列與琴葉擬南芥、擬南芥的基因序列進行比對，相似性分別為84.38%、81.8%。圖2～5

圖1 獨行菜總RNA檢測結果
Fig.1 Total RNA electrophoresis results of Lepidium apetalum

注：M：2 000 bp marker；1：目的基因LaCBF3 442 bp片段；2：目的基因LaCOR15a405 bp片段

Note: M:2,000 bp marker; 1: Target geneLaCBF3 442 bp; 2: Target geneLaCOR15a405 bp

圖2 LaCBF3及 LaCOR15a PCR擴增結果
Fig.2 LaCBF3 and LaCOR15a gene fragment electrophoresis test results of PCR amplification

注：M：2 000 bp marker；1～3：LaCBF3陽性克隆PCR擴增結果；4～6：LaCOR15a陽性克隆PCR擴增結果

Note: M: 2,000 bp marker ; 1-3: amplification result ofLaCBF3; 4-6: amplification result ofLaCOR15a

圖3 陽性克隆的菌液PCR擴增結果
Fig.3 PCR amplification results of positive clones

圖4 獨行菜LaCBF3與擬南芥的同源序列比對結果
Fig.4 LaCBF3 alignment results compared with Arabidopsis thaliana

圖5 LaCOR15a與擬南芥的同源序列比對結果
Fig.5 LaCOR15a alignment results compared with Arabidopsis thaliana

2.3 脅迫處理下LaCBF3和LaCOR15a表達結果

半定量RT-PCR結果顯示在不同脅迫處理下，LaCOR15a基因均被誘導表達，表達模式有一定差異，而在未經處理的獨行菜幼苗葉片中不表達；4℃低溫處理8 h時LaCOR15a開始表達并隨著處理時間的延長表達量有增加趨勢，而100 μmol/L ABA、2% NaCl、20% PEG6000誘導下則在0.5 h已經開始表達。與LaCOR15a表達模式不同的是，在鹽脅迫、干旱脅迫以及外源ABA處理條件下，均未檢測LaCBF3的表達，僅在4℃低溫處理條件下LaCBF3在0.5 h開始表達，并且LaCBF3的轉錄要明顯早于LaCOR15a。圖6

A:20% PEG6000; B: 2% NaCl ; C: 100 μmol/L ABA; D: 4℃

圖6 脅迫處理下抗冷相關基因的表達分析
Fig.6 Expression analysis of cold resistance genes under stress treatment

3 討 論

低溫脅迫對植物造成的傷害主要體現在：植株細胞膜系統受損，積累大量活性氧，引起代謝紊亂；部分蛋白質變性、失活，無法執行正常的生理功能；細胞的超微結構如：葉綠體、線粒體、類囊體、染色質等受到不同程度的損傷[20]。除此之外，開花植物的生殖發育也受到一定程度的影響。研究發現，低溫脅迫可造成擬南芥花粉發育不良，花粉管通道生長受阻，引起種子數量的減少[21]。長期的自然選擇及進化使植物形成一套自身獨特的耐低溫體制，植物在應對低溫脅迫的過程中主要通過依賴于ABA 和不依賴于ABA兩條途徑，二者相互聯系形成調控網絡，提高植物的耐寒性[22]。

實驗材料獨行菜是一種早春短命植物，能在早春低溫環境中萌發并生長，為探討其幼苗生長階段對低溫的耐受機制，對獨行菜LaCBF3及LaCOR15a基因核心片段進行克隆并初步分析這兩個基因的表達情況，結果表明：干旱、高鹽、外源ABA和4℃低溫處理條件下均能迅速誘導低溫響應基因LaCOR15a的表達，而其上游的轉錄調控因子LaCBF3對干旱、高鹽、ABA無響應，僅在低溫誘導下迅速表達。Medina等[23]研究發現，野生型擬南芥植株中CBF基因為低溫特異誘導表達基因，不受ABA和干旱脅迫的調控。ABA參與調控植物生長發育的重要過程，同時也作為一種信號分子應答植物對逆境脅迫的反應。Daie等[24]研究表明，外源施加ABA 能夠增強植物的抗寒性。實驗中100 μmol/L ABA能快速誘導LaCOR15a的表達，但不誘導LaCBF3的表達，推測LaCBF3可能通過不依賴于ABA的途徑響應低溫脅迫。2% NaCl 處理下，短時間內即可誘導LaCOR15a的表達。Liu等[25]發現200 mM NaCl處理可誘導擬南芥幼苗中COR15a基因的快速表達。植物響應干旱脅迫的分子機制與響應低溫脅迫類似，在擬南芥中COR作為低溫信號通路中重要的下游基因同時響應干旱脅迫[26]。實驗中20% PEG6000及4℃低溫處理均能引起LaCOR15a的表達，而LaCBF3只對4℃低溫脅迫有快速應答，LaCOR15a則在4℃低溫處理8 h時開始表達，這與Gilmour[27]的研究結果相似，擬南芥中CBF3基因的轉錄水平在15 min內開始增長，COR基因的表達啟動稍晚，2 h后開始被誘導，低溫響應途徑中的基因表達具有時序性。

已有許多植物物種中的COR15a基因進行了分離與功能鑒定。低溫脅迫下，高山離子芥CbCOR15基因在葉片中特異表達，過表達該基因提高了煙草的抗凍能力[28 ]。薺菜CbCORl5a基因在常溫環境下的葉片中有微量表達，而低溫條件下，CbCORl5a在葉片和根中表達量增強[29]。在擬南芥中過表達CBF3基因，不僅提高了COR蛋白的含量，而且也提高了脯氨酸及可溶性糖的含量[30]。低溫響應蛋白AtCORl5a是第一個具有直接證據證明其參與了抗凍的蛋白[31]。關于COR15a 蛋白的功能，Thalhammer等認為在低溫冷凍過程中，隨著溫度的降低，植物細胞膜之間緊密連接，引起 COR15a蛋白部分折疊成α-螺旋，通過與穩定在葉綠體膜上MGDG分子的H-鍵相互作用，維持并穩定低溫冷凍過程中的細胞膜完整性，減少電解質泄漏，從而提高植株的抗寒性[32]。

隨著基因工程技術的發展，通過對不同物種CBF低溫響應途徑中關鍵基因進行分離鑒定，構建多價表達載體，通過共轉化，使植株獲得更高的抗寒性。尤其是對定向改良冷敏感的植物如水稻、番茄等具有積極的指導意義。

4 結 論

克隆獲得LaCBF3及LaCOR15a核心片段并對其在逆境脅迫下的表達情況進行了分析，結果表明LaCBF3僅響應低溫脅迫，干旱、高鹽、外源ABA等不能誘導其表達，推測LaCBF3可能通過不依賴于ABA的途徑響應低溫脅迫。LaCOR15a對干旱、低溫、高鹽、外源ABA等非生物脅迫均有響應，其在獨行菜響應非生物脅迫過程中均具有重要作用。

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