脫水方式對無核白葡萄酚類代謝及品質的影響

肖超男，白羽嘉，陳 雪，章思博，古力尼格爾·玉散江，黃文書,2

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學園藝學博士后流動站，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】中國是世界上最大的綠色葡萄干生產國，新疆吐魯番地區是中國葡萄干主要產地，其特色產品為無核白葡萄陰干的綠葡萄干。據統計，2012年葡萄產量占新疆水果產量的28.7%[1]。由于葡萄成熟期比較集中，采后脫水干制是葡萄加工的一個重要方式。無核白葡萄(VitisviniferaL.varWuhebai)是生產綠葡萄干的主要品種。傳統晾房生產的無核白葡萄干褐變現象極其普遍，已成為制約新疆葡萄干產業持續健康發展的關鍵性問題，因此，無核白葡萄采后脫水干制褐變機理的研究顯得尤為重要。多數研究認為葡萄干褐變的原因是無核白葡萄皮或葡萄果肉中的酚類物質在多酚氧化酶(PPO)的作用下，被氧化變成醌及其聚合物并反應發生褐色素或黑色素造成褐變的現象[2]。酚類物質是葡萄果實中重要的次生代謝產物，與葡萄采后運輸、貯存、保鮮等品質指標密切相關。因此，酚類物質研究一直是葡萄采前、采后研究的重要熱點之一。苯丙烷類代謝途徑是植物次生物質代謝的一條重要途徑，與酚酸、類黃酮等酚類物質和木質素、羥基肉桂酸酯等許多次生代謝物的合成有關。研究表明，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)，4-香豆酸酰輔酶連接酶(4CL)是苯丙烷類代謝途徑的三個關鍵酶[3-4]。【前人研究進展】由劉峰娟[5]研究發現，緩慢脫水和快速脫水處理的無核白葡萄在質量損失皆為50%時出現明顯褐變現象，并在其蛋白質組學的研究中揭示葡萄果實褐變與無核白葡萄干制過程中次生代謝產物類黃酮和酚類含量及代謝的變化有關。烘箱干燥是一種便捷、經濟、易于推行的機械干燥方法。在干燥物料時通常使用熱風循環烘箱，熱風在熱風循環烘箱箱內循環，熱效率高，節約能源，烘箱內設有可調式分風板，物料干燥均勻，且適用范圍廣，可干燥各種物料，具有投資低、管理方便等優點，是一種通用的干燥設備[6-9]。用烘箱干燥果蔬已有大量報道，張利娟等[10]研究了熱風干燥對無核白葡萄總酚和抗氧化性的變化，張英麗等[11]研究了無核白葡萄經過熱風干燥后的品質。徐飛等[12]對菠蘿蜜的研究結果表明，抗壞血酸隨著溫度升高，含量在降低；李煥榮等[13]對紅棗熱風干燥進行了研究，發現采用相對較低的干制溫度，能最大限度地減少營養成分的損失。孟陽等[14]分別在30、35、40和45 ℃ 條件下進行熱風干燥，得出在干燥無核白葡萄過程中，葡萄中的抗壞血酸、可滴定酸、總酚含量下降，而褐變度上升。 【本研究切入點】研究不同脫水干制方式對無核白葡萄干制過程中酚類代謝及品質特性的影響。【擬解決的關鍵問題】以富含酚類物質的無核白葡萄果實為材料，檢測兩種不同干制方式對無核白葡萄干制過程中酚類、總類黃酮、苯丙烷類代謝酶系(包括PAL、C4H、4CL)的指標。為闡明苯丙烷類代謝物質變化及無核白葡萄酚類類黃酮等物質合成中的生理功能提供依據，為提高無核白葡萄干的品質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 無核白葡萄

購于北園春水果市場，挑選成熟度一致、健康、無病蟲害及腐爛果，果實色澤碧綠，果穗及顆粒大小均勻(直徑為9.4 mm±1.12 mm；長度為14.00 mm±1.14 mm)，可溶性固形物質量分數為20%±2.5%，含水率為80%±0.82%的果實為試驗材料進行以下處理。將挑選好的試驗樣品隨機均勻分成兩組：快速脫水工藝條件：將修剪大小一致葡萄串平放于熱泵干燥箱中的托盤里，熱風處理溫度40℃，相對濕度<20%；緩慢脫水工藝條件：將葡萄置于搭制的晾架上自然脫水，環境平均溫度為25℃，平均相對濕度45%。隨時計算葡萄的質量損失，當葡萄脫水質量損失率達到60%時結束取樣，在此過程中分別在葡萄質量損失率為10%、20%、30%、40%、50%和60%時取樣，測定各項指標，每個處理重復3次。

1.1.2 儀器與試劑

紫外—可見分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

高速冷凍離心機：TGL-16G型，上海安亭科學儀器廠；

冰箱：DW-FL90-40℃，(中科美菱)；

超聲波清洗器：SK2200H型，上海科導超聲儀器有限公司;

電子天平：FA2104N型，上海民橋精密科學儀器有限公司;

電熱恒溫恒濕干燥箱：CS101型，烏魯木齊電器設備制造廠;

氫氧化鈉：分析純，天津市光復科技發展有限公司;

甲醇：分析純，天津市福晨化學試劑廠;

福林肖卡：優級純，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 測定指標

1.2.1.1 褐變度

1)公交刷卡乘客上車站點識別包含2個模型，基于IC卡刷卡時間識別(模型2)相較于基于GPS時間識別(模型1)存在明顯缺陷，部分站點缺乏刷卡數據或部分乘客刷卡時公交車輛已經駛離站點，這些缺陷會導致下車站點無法識別或識別錯誤. 并且利用實際數據試算時發現采用模型2識別，站點序號基本對應不上，而模型1站點識別率高達98.31%，所以最終選取模型1為識別模型.

稱取2.0 g(以干質量計)冷凍的無核白葡萄果實，在液氮條件下研磨粉碎，加入10倍的蒸餾水，旋渦勻漿后，在4℃條件下8 000×g離心25 min，取離心后得到的上清液在波長為420 nm處測定其吸光度值，褐變度以A420表示，空白對照為蒸餾水[15]。

1.2.1.2 總酚

總酚采用福林肖卡試劑法[15]測定，以μg/g表示。酚標準溶液(5 mg/g)配制：稱取0.500 g沒食子酸，先用10 mL乙醇溶解，再用蒸餾水定容至100 mL。標準曲線的制作：用微量移液器從0、50、75、100、125、150、250和500 mg/L的系列沒食子酸標準溶液中吸取250 μL分別加入25 mL比色管，加蒸餾水12.5 mL，混合搖勻，加入福林肖卡顯色劑1.25 mL，20%碳酸鈉溶液3.75 mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。顯色反應2 h后在765 nm波長下測定系列標準溶液的吸光度A，繪制標準曲線。

1.2.1.3 總黃酮

采用亞硝酸鈉與硝酸鋁顯色法[16]測定，以μg/g表示。標準曲線的制作：精確稱取置于120℃下干燥至恒重的蘆丁5.00 mg，用50%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，震蕩搖勻。用移液槍分別吸取蘆丁標準液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL比色管中，分別加入5 mL 50%乙醇溶液，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min后加入0.3 mL 5%硝酸鋁溶液搖勻，靜置6 min后加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，并用50%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12 min后放置于504 nm處測吸光值A，繪制標準曲線。

1.2.1.4 PAL酶活性

參照曹建康[17]的方法并修改。取3 g冷凍果肉組織，加入3 mL pH 8.0、0.1 mo1/L的硼酸緩沖液(內含10% (w/v) PVPP，1 mmol/L EDTA和50 mmol/L β-巰基乙醇)用液氮充分研磨，然后于4 ℃，8 000×g條件下離心30 min，收集上清液并立即用于酶活性測定。反應體系為：取1 mL pH 8.0，0.02 mol/L L-型苯丙氨酸溶液用硼酸緩沖液配制，6 mL pH 8.0，50 mmol/L 硼酸緩沖液，先將反應液于30℃水浴反應10 min，然后加入 1 mL粗酶液，在290 nm處測定吸光度值，空白加1 mL蒸餾水，不加酶液，其余同反應體系。酶活性以每小時每克鮮重果蔬組織反應吸光度增加0.01時為1個PAL活性單位(U)，活性以U/h/g/FW表示。樣品重復測3次。

1.2.1.5 肉桂酸羥化酶(C4H)活性

1.2.1.6 4-香豆酸-輔酶A連接酶(4CL)活性

粗酶液制備：取2 g冷凍果肉，加入4 mL 0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液(50 mmol / L pH 8.9 Tris-HCl 緩沖液，15 mmol/Lβ-巰基乙醇，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L VC，10 μmol /L 亮抑酶膚，1 mmol/L PMSF，0.15%( w/v ) PVP，30%甘油)，混勻后，超聲破碎2 min，然后于4℃，8 000×g條件下離心30 min，收集上清液即為4CL粗酶提取液，并立即用于酶活測定。反應體系：1.8 mL 15 μmol/L(硫酸鎂或氯化鎂)Mg2+，0.6 mL μmol/mL p-香豆酸，0.6 mL 50 μmol/mL ATP，0.6 mL μmol/mL CoA以及2 mL酶液于40℃下反應10 min，在333 nm處測定吸光度值，以1 min內OD值變化0.1為1個活性單位(U)。酶活性單位為U/min/g/FW，對照不加香豆酸。樣品重復測3次。

1.3 數據處理

采用DPS數據處理系統軟件對試驗數據進行單因素方差分析和相關性分析，Origin 9.0軟件繪圖。鄧肯氏多重差異比較，當P<0.05 時，表示差異顯著，當P<0.01時，表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同干制處理對無核白葡萄褐變度的影響

研究表明，在兩種不同干制方式脫水處理下的無核白葡萄，其褐變度呈現上升的趨勢。在無核白葡萄質量損失為30%之前，其褐變度上升趨勢較為緩慢。自然陰干處理的無核白葡萄在質量損失為30%后褐變度上升速度加快，而此時無核白葡萄已經開始出現較為顯著的褐變現象。之后褐變度隨著脫水的進行而進一步的升高。在質量損失為60%時，無核白葡萄的褐變度由最初的0.05增大到結束取樣時的1.15，增大了23倍。在質量損失為40%時，熱風干制處理的無核白葡萄較自然陰干處理褐變明顯，之后褐變現象發展迅速，當質量損失為60%結束取樣時，褐變度為1.03，是自然陰干脫水處理的89.50%(P<0.01)。無核白葡萄在自然陰干脫水處理下褐變度顯著高于熱風干制脫水處理(P<0.05)，說明無核白葡萄在熱風干制脫水處理下可以有效減緩其褐變的發生。圖1

2.2 不同干制處理對無核白葡萄總酚含量影響

研究表明，自然蔭干和烘箱干制兩種干制處理方式隨著質量損失率的增加，均對總酚含量呈現明顯的降低趨勢，這與劉峰娟[5]、張利娟[10]等對熱風干制處理無核白葡萄的研究結果一致，多酚含量呈整體下降的趨勢。果實的酶促褐變底物為酚類物質，因此，酚類物質與褐變關系十分密切，在劉峰娟[5]的研究中，無核白葡萄干制過程中褐變度也呈上升趨勢，與研究的總酚含量變化研究結果一致。當質量損失率為50% 時，此時兩種干制的總酚含量相同，其中方差分析可得，在質量損失率為60%之內時對總酚含量的影響極為顯著(P<0.01)。 圖2

圖1 不同干制處理對無核白葡萄褐變度影響
Fig.1 Effect of different drying treatments on browning degree of white grape seedless

圖2 不同干制處理下無核白葡萄總酚含量變化
Fig.2 Effect of different dry treatments on total phenolic content of seedless white grape

2.3 不同干制處理對無核白葡萄黃酮含量影響

研究表明，自然蔭干和烘箱干制兩種干制處理方式隨著質量損失率的增加均可降低總黃酮的含量。其中，烘箱干制在失水率為40%之內時持續下降，之后失水率緩慢降至到60%，由最初的總黃酮含量持續降至7.88 μg/g，低于對照組，而葡萄果實發生褐變即在質量損失為50%時，烘箱干燥時的總黃酮含量低于對照組。由方差分析可知，在質量損失率為60% 之內時對總酮含量的影響較為顯著(P<0.01)。圖3

圖3 不同干制處理下無核白葡萄黃酮含量變化
Fig.3 Effect of different dry treatments on flavonoid content of seedless Grapevine

2.4 不同干制處理對無核白葡萄果實PAL活性的影響

研究表明，自然蔭干和烘箱干制兩種干制脫水方式對PAL活性有一定的作用，在質量損失率0～20%時，PAL的活性呈現降低的趨勢，其中，烘箱干制的PAL活性低于對照組；接著質量損失率在20%～40%，其活性又逐漸的增強，最后，在干燥率達到60%時，PAL的活性逐漸降低，說明在果實褐變時PAL的活性正處于逐漸降低的過程，在質量損失率為60%之內時 ，兩種干制處理差異較顯著(P<0.05)。圖4

圖4 不同干制處理下無核白葡萄果實PAL活性變化
Fig.4 Effects of different dry treatments on PAL activity in seedless white grape

2.5 不同干制處理對無核白葡萄果實C4H活性的影響

研究表明，自然蔭干和烘箱干制兩種干制處理方式對C4H酶活性的作用趨勢一致，在整個質量損失的過程中，兩種處理方式均能不同程度的增強C4H酶的活性。其中在質量損失率0～10%、20%～40%、50%～60%的階段時C4H酶的活性呈上升趨勢。反之，在質量損失率為10%～20%、40%～50%時C4H酶的活性呈下降趨勢；其中在無核白葡萄質量損失率為50%時，烘箱干制處理下的酶活性出現最低點為0.38 U/h/g/FW，說明在葡萄果實褐變時C4H酶的活性較低為0.44 U/h/g/FW但高于對照組。隨后在量損失率一直持續達到60%時，烘箱干制方式處理下的C4H酶活性一直升高。且在此過程中兩種處理方式下的酶活性都增至最高。在質量損失率為60%之內時，兩種干制處理差異顯著(P<0.05)。圖5

圖5 不同干制處理下無核白葡萄果實

C4H活性變化

Fig.5 Effect of different dry treatments on

C4Hactivityofseedlesswhitegrape

2.6 不同干制處理對無核白葡萄果實4CL活性的影響

研究表明，自然蔭干和烘箱干制兩種干制處理方式對4CL酶活性的作用趨勢一致，在整個質量損失的過程中，其中在質量損失率0～10%、30%～40%、50%～60%的階段時4CL酶的活性呈上升趨勢。反之，在質量損失率為10%～20%、40%～50%時4CL酶的活性呈下降趨勢；而在此過程中自然蔭干和烘箱干制處理下的酶活性分別達到最低點和最高點，其中在無核白葡萄質量損失率為20%時，自然蔭干酶活性最低點為0.35 U/h/g/FW，而烘箱干制處理下的酶活性最低點為0.34 U/h/g/FW，低于對照組；隨后在量損失率一直持續達到50%時即果實褐變時，兩種干制方式處理下的4CL酶活性出現轉折點呈降低趨勢。圖6

圖6 不同干制處理下無核白葡萄果實4CL活性變化
Fig.6 Effects of different dry treatments on 4CL activity in seedless white grape

2.7 不同干制處理無核白葡萄總酚、黃酮變化與褐變度變化的相關性分析

研究表明，不同脫水方式處理無核白葡萄干制過程中總酚、黃酮含量變化與兩種干制方式處理的褐變度變化的相關系數均在0.5以上，尤其總酚含量的變化與褐變度的相關性達到極顯著水平，說明隨著脫水過程中無核白葡萄褐變度的升高，酶促褐變的反應底物總酚和總黃酮含量呈現逐漸降低的趨勢。表1

表1 總酚、黃酮含量變化與兩種干制方式褐變度相關性
Table 1 Changes of Total Phenols and Flavonoids Content and Correlativity between Two Drying Methods Brown Degree

指標Index自然陰干干制處理褐變度Browning of slow drying treatment烘箱干制干制處理褐變度Browning of rapid drying treatment總酚-0.896**-0.864*總黃酮-0.772*-0.833*

注：**表示極顯著，P<0.01；*表示顯著，P<0.05

2.8 不同干制處理無核白葡萄PAL、C4H、4CL活性變化與酚類物質變化的相關性

研究表明，不同脫水方式處理'無核白'葡萄干制過程中PAL、C4H、4CL活性變化與酚類物質總酚和黃酮含量變化的相關系數均在0.5以上，尤其是4CL和C4H活性變化與酚類物質的相關性達到顯著水平，表明在脫水過程中苯丙烷類代謝酶4CL和C4H與葡萄酚類物質的變化有較高的相關性。表2

表2 PAL、C4H、4CL活性變化與酚類物質含量變化相關性

注：**表示極顯著，P<0.01；*表示顯著，P<0.05

3 討 論

無核白葡萄果實富含花色苷和多酚類等生物活性成分，具有非常強的自由基清除能力和抗氧化活性，且隨著干制時間的延長，酚類物質含量及抗氧化活性呈降低趨勢[5]。但無核白葡萄果實采后酚類物質含量與苯丙烷代謝的關系尚不清楚。前人研究表明，在苯丙烷類代謝過程的相關酶活性對于合成酚類物質有著重要的影響，隨著苯丙烷代謝途徑中關鍵酶PAL、C4H、4CL活性的升高，植物體內積累大量酚酸、類黃酮等酚類物質[20]。在無核白葡萄兩種不同脫水方式干制處理過程中，對PAL、C4H、4CL活性與兩種脫水方式處理的總酚和黃酮含量進行相關性分析發現，4CL和C4H活性變化與總酚和總黃酮類物質的相關性達到顯著水平。表明PAL、C4H、4CL活性變化與無核白葡萄脫水干制過程中的酚類物質變化密切相關。但總酚、總黃酮含量的變化趨勢與C4H和4CL活性的變化趨勢正好相反。通過分析，也顯示這兩種酶的活性與葡萄總酚、總黃酮含量存在負相關關系，這與孫坤的研究結果類似，其主要原因可能是：苯丙烷類代謝的產物中除酚類化合物、黃酮類化合物外，還有其他包括木質素等次生代謝物質，而酚類物質、黃酮類化合物含量的高低不僅與相關酶活性有關外，還與次生代謝的中間產物酚類、木質素、類黃酮等化合物的分配有關。在脫水處理過程中，葡萄苯丙烷類代謝被激活，PAL、C4H和4CL活性升高，而總酚和總黃酮含量并沒有提高，可能與更多中間代謝產物用于木質素等其他次生代謝產物的生物合成有關。也可能與酚類物質在PPO、POD催化下氧化、聚合，不斷被消耗有關。

4 結 論

4.1 無核白葡萄脫水干制過程中，自然陰干和40℃熱風干制兩種方式處理無核白葡萄的褐變度與總酚、總黃酮含量都呈現顯著的負相關關系(P<0.05)。

4.2 在脫水過程中，葡萄苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)活性呈現先增高再降低的趨勢；而4-香豆酰-輔酶A連接酶(4-coumaryl-CoA ligase，4CL)和肉桂酸-4-羥化酶(Cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H)的活性總體呈持續上升趨勢。在脫水前期，自然陰干葡萄PAL活性顯著高于熱風干制葡萄。在脫水前期熱風干制葡萄C4H活性低于自然陰干葡萄，但質量損失超過30%后，熱風干制葡萄C4H活性顯著高于自然陰干葡萄(P<0.05)。葡萄4CL酶活性在整個脫水過程中兩種處理間都無顯著差異。苯丙烷代謝關鍵酶C4H、4CL活性變化與無核白葡萄脫水干制過程中的總酚、總黃酮類呈負相關的關系。

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