葡萄糖激酶的克隆表達＊

王佳寧 陳少云

（浙江中醫藥大學生命科學學院，浙江杭州 310053）

輔酶是一種可以把化學基團在酶與底物分子間相互轉移的有機小分子，在一些酶的催化過程中必不可少。由于輔酶價格昂貴，工業中常用輔酶再生的方法滿足酶促反應對輔酶的需求。在前期研究中，我們利用Pichia pastoris GS115的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶GpdPP和己糖激酶HK偶聯，構建了一個高效的輔酶NADPH再生體系（GpdPP-HK）。葡萄糖激酶(GK)，在哺乳動物的胰腺以及肝臟中普遍存在，可在ATP存在時將葡萄糖磷酸化，生成6-磷酸葡萄糖。本文通過構建含有葡萄糖激酶GK基因的工程菌，實現克隆表達，優化表達條件，為與GpdPP偶聯的輔酶N A D P H再生體系貢獻新的酶源。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

超凈工作臺、壓力蒸汽滅菌器、臺式高速冷凍離心機、恒溫培養振蕩器、PCR自動系列化分析儀、超聲波細胞破碎儀、電泳儀。

Escherichia coli BL21(DE3)，pCDFDuet-1，HEPES、IPTG、4×Protein SDS PAGE Loading Buffer、Protein Marker、輔酶、PrimeSTARMAX DNA Polymerase。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR

PCR條件：（1）預變性95 ℃ 2 min。（2）變性98 ℃ 10 S，退火55 ℃ 15 S，延伸72 ℃ 20 S，循環30次。（3）延伸72 ℃ 2 min。（4）16 ℃ 5 min。

引物序列如下：

F-G K B S:C G G A A T T C G A T G G A C G A G A T A T G GT TTG CG GG

R-G K B S:C C G C T C G A G T T A A C A A T T T T G A T GTT TCAG CCAT TCAT TTTT AG

1.2.2 誘導

在含抗生素的液體LB中加入1 %的種子液，培養至OD為0.6～0.8時停止培養，加入0.5 mM IPTG進行誘導培養。

1.2.3 菌體收集與細胞破碎

靜息細胞菌懸液的制備：取適量培養好的菌液，8000 rpm 4 ℃離心5min，除去上清，ddH2O潤洗2次，再用HEPES緩沖液重懸菌體。

細胞破碎液的制備：取2 mL上述菌液至5 mL離心管中，置于冰上，用超聲破碎儀破碎30次，破3 S，停7S，Ampl 25 %。

粗酶液的制備：將此細胞破碎液12000 rpm 4 ℃離心1min，取上清。

1.2.4 酶活力的測定

參考文獻[4]。

1.2.5 工程菌表達條件的優化

圖1 重組質粒pCDFDuet-GK圖譜

圖2 優化表達條件蛋白電泳圖

（1）誘導溫度：將搖床溫度分別設置為16℃、20℃、30℃、37 ℃ ，在OD為0.6時，加入 0.6 mM IPTG，誘導12 h。（2）誘導時機：將搖床溫度設為16 ℃，控制OD為0.6、0.9、1.2、1.5時，加入0.6 mM IPTG，誘導12 h。（3）誘導強度：將搖床溫度設為16 ℃，OD為0.6，分別加入0.3 mM、0.6 mM、0.9 mM、1.2 mM IPTG，誘導12 h。（4）誘導時間：將搖床溫度設為16 ℃，OD為0.6，加入0.6 mM IPTG ，分別誘導8 h，12 h，16 h，20 h。

2 結果與分析

圖3 優化表達條件對GK表達的影響

2.1 含重組質粒pCDFDuet-GK的工程菌的構建

通過PCR，從Bacillus subtilis 168基因組擴增目的基因GK（NCBI登錄號：NC_000964.3），再經過酶切、酶連、轉化構建重組質粒pCDFDuet-GK，經測序驗證質粒無誤。利用重組質粒pCDFDuet-GK，被轉化為感受態細胞E. coli BL21（DE3）后，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，得到PCR產物大小位于750與1000之間，這與基因序列966bp一致，說明工程菌構建成功。

2.2 葡萄糖激酶GK的表達優化

經過工程菌表達條件的優化，通過分析電泳圖，對比各組泳道1和泳道2、3，空白細胞均沒有表達出目標蛋白。對比泳道2、3表明重組后的工程菌經過誘導，表達出的蛋白質在29 kDa - 44.3 kDa之間，與目標蛋白一致。而且各組泳道3沉淀中含有的包涵體均很少，說明大部分表達出的均是可溶蛋白。

經過對工程菌表達條件的優化，測量酶活得到最優誘導溫度為16℃，最優誘導時機為OD值為0.6，最優誘導強度為0.6 mM IPTG，最優誘導時間為12h，在此些表達條件下，酶活最高為6.6 U/L。

3 結語

本實驗成功構建重組質粒E.coil BL 21(pCDFDuet-GK)，并優化了工程菌的各個表達條件，16 ℃是最優誘導溫度，OD值0.6是最優誘導時機，0.6 mM IPTG是最優誘導強度，12 h是最優誘導時間，優化后的酶活為6.6 U/L。

[1]林璐,李莎,朱宏陽,等.固定化細胞生物催化合成異麥芽酮糖[J].食品與發酵工業,2008,34(3):29-32.

[2]李卉.輔酶I的聚乙二醇修飾[D].杭州:浙江大學,2005.

[3]江金鵬,吳旭日,陳依軍.解決氧化還原酶反應體系中輔酶問題的策略及其應用[J].生物工程學報,2012,28(4):410-419.

[4]鄭雅楠,陳少云,劉文洪,等.基于己糖激酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶共表達的輔酶NADPH高效再生[J].微生物學通報,2016,43(12):2619-2626.

[5]Iynedjian P B,Gjinovci A,Renold A E.Stimulation by insulin of glucokinase gene transcription in liver of diabetic rats[J].Journal of Biological Chemistry,1988,263(2):740-744.

[6]Wang H,Iynedjian P B.Modulation of glucose responsiveness of insulinoma β-cells by graded overexpression of glucokinase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1997,94(9):4372-4377.