宮頸癌及癌前病變中的HPV-16的整合感染狀態

熊礦輝，王麗霞，周 紅

(浙江省醫療健康集團杭州醫院婦產科，浙江 杭州 310022)

生殖道人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染誘發女性宮頸癌是目前普遍認可的主要因素[1]。據相關流行病學研究結果顯示，僅為HPV感染不足以導致發生宮頸癌，而在受到高危型HPV感染且發生HPV病毒與宿主基因組發生整合狀態時，宮頸上皮細胞會發生惡性轉化，從而可能導致宮頸癌的發生。在宿主不同的DNA開放讀碼框架處，HPV均可以在此與宿主基因組發生整合[2-3]。其中，不穩定的E2基因鉸鏈區是高危HPV整合宿主基因組最常見的缺失或斷裂部位[4]。在高危HPV病毒類型中，最常見的就是人類乳頭瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV-16)[5-6]，本次研究中，采用重疊定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術探討各宮頸病變組織中HPV-16 E2基因的缺失從而判斷HPV-16與宿主基因組的整合情況，并初步探討HPV-16整合狀態及其與誘發宮頸癌之間的關系和臨床意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本

選取2012年2月至2014年12月在浙江省醫療健康集團杭州醫院活檢，宮頸錐切術及廣泛性全子宮切除術后獲得的宮頸病變組織存檔蠟塊標本252例為研究組，并根據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)女性生殖道腫瘤組織學分型標準，將標本分別劃分為48例宮頸癌及204例宮頸上皮內瘤樣病變組織(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)，其中包括CIN Ⅰ125例,CIN Ⅱ46例，CIN Ⅲ33例。另外將同時期因子宮肌瘤于我院行子宮全切術后提取的20例正常宮頸上皮組織作為對照組。所用標本患者均為已婚婦女且在取檢前均未行任何化療或放射治療，年齡為27～68歲，平均年齡46歲。將蠟塊標本進行常規切片和蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后顯微鏡下觀察，取細胞無異常的組織切片用于進一步實驗。所有研究對象均知情同意。

1.1.2細胞系

細胞系在37℃、5%CO2、飽和濕度環境下，將人宮頸癌細胞株SiHa、CasKi(美國生物物種保藏中心)分別于10%胎牛血清的達爾伯克氏改良伊格爾(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)培養液和洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)培養液中。

1.2方法

1.2.1石蠟切片的DNA的提取

提取石蠟切片中的DNA 對每塊蠟塊標本中進行1μm厚切片，然后每塊蠟塊各取3片進行下一步試驗。對切片進行脫蠟并分別加入30μL蛋白酶K溶液，30μL 20%SDS和500μLTES溶液，于56℃水浴72h；繼續按比例用酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)抽提2次，然后進行離心并棄去上清液后加入無水乙醇2倍體積和3mol/L的乙酸鈉1/10體積，再次離心后棄上清液并于真空泵中進行沉淀干燥，最后于沉淀中加入少量TE緩沖液進行溶解。完成DNA的提取。

1.2.2 HVP-16感染的確定

HPV-16感染的確定當在DNA水平和蛋白質水平兩個分子水平上均檢測陽性可以判斷HPV-16感染。①DNA水平確定HPV-16感染：用PCR檢測計算機軟件輔助設計的HPV-16 E7基因以確認為HPV-16感染，設計的HPV-16 E7基因序列為：上游引物5’-AGAAACCCAGCTGTATCAT-3’，下游引物5’-TTATGGTTTCTGAGAAGAGA-3’；②蛋白質水平確定HPV-16感染:采用免疫組化SP法檢測切片組織中HPV-16 E7的表達的蛋白質水平從而確定HPV-16感染，具體步驟參照文獻所述[7]。

1.2.3確定HPV-16整合

HPV-16與宿主基因組織整合的確定采用重疊PCR法分別擴增確認為HPV-16感染標本的HPV-16 E2基因中的3個相互間有序列的的交叉小片段來確定是否存在病毒整合情況，A、B、C 3個交叉小片段的引物序列分別如下，見表1。

表1各片段的引物序列

Table 1 Sequence of primers in each fragment

片段上游引物序列(5'-3')下游引物序列(5'-3')A(475p)AGCACGAGGGACAGGAAAAACTTGACCCTCTACCACAGTTACTB(477p)TTGTGAAGAAGCATCAGTAACTTAAAGTATTAGCATCACCTTC(176p)GTAATAGTAACACTACACCCATAGGATGCAGTATCAAGATTTGTT

當片段A、B、C 3個不能同時陽性擴增時，提示HPV-16 E2基因存在缺失，從而代表HPV-16與宿主基因組發生了整合。HPV-16發生整合感染僅僅能擴增出C片段，而發生HPV-16的游離感染的標本能擴增出A、B、C 3個片段(以Caski和SiHa細胞株的DNA作為陽性)，見圖1。

注：M為marker;1為Caski;2為SiHa;3為CIN ;4為CIN ;5，6為Cervical Carcinoma(integrated);7為control

圖1重疊PCR擴增HPV-16 E2不同片段判斷HPV-16整合狀態

Fig. 1 Overlapping PCR amplification of different fragments of HPV-16 E2 to judge HPV-16 integration

1.3統計學方法

應用SPSS 10.0統計軟件對文中相關數據進行分析，計量資料采用t檢驗，計數資料采用卡方檢驗。P<0.05時為差異有統計學意義。

2結果

2.1 HPV-16感染確定情況

根據PCR擴增HPV-16 E7基因結果顯示，正常宮頸上皮組織，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的組織HPV-16感染例數分別為1、30、20、18和34例，而對應的根據免疫組化蛋白測定確定HPV-16感染結果為陽性例數分別為2、28、19、16和33例。因此正常宮頸上皮組織，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的組織中兩者均陽性的確定HPV-16感染的例數分別為1、23、17、15和33例，且各組HPV-16感染率為5.0%(1/20)、18.4%(23/125)、36.9%(17/46)、45.5%(15/33)、68.8%(33/48)，隨著病變程度的增高感染率也增高，差異有統計學意義(P<0.001)，見表2。

表2不同病變程度宮頸上皮組織的HPV-16感染率的比較

Table 2 Comparison of HPV-16 infection rates among

cervical lesions with different degrees

2.2 HPV-16與宿主基因組整合的確定

根據重疊PCR擴增HPV-16 E2基因不同片段確定HPV-16整合結果提示，在確定HPV-16感染的標本中，正常宮頸上皮組織標本的結果提示為游離感染，而CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌組織標本的整合例數分別為4、3、5和18例，整合率分別為16.7%(4/24)、18.8%(3/16)、35.7%(5/14)、58.1%(18/31)，隨著病變程度的增高整合率也增高，差異有統計學意義(P=0.0056)，見表3。

表3不同病變程度宮頸上皮組織的HPV-16整合率的比較

Table 3 Comparison of HPV-16 integration rates

among cervical lesions with different degrees

3討論

3.1 HPV-16感染與宮頸病變程度關系

宮頸癌是世界上婦科腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，據相關統計學研究顯示世界上每年約有19萬女性死于宮頸癌，其中超過半數案例是發生在發展中國家。我國每年的宮頸癌病例約為10萬，占世界總發病人數的1/3[8]，所以宮頸癌嚴重的影響著我國女性的生命健康，對此進行的防治工作刻不容緩。

直到目前，有大量的實驗室研究以及流行病學研究結果都證明，HPV病毒感染是引起宮頸癌發生的最主要因素，并且高危型的HPV病毒持續感染是主要的病因[2,9]。在多種高危型HPV類型中，HPV-16感染是最常見的引起宮頸癌發生的主要類型。本次研究結果顯示，HPV-16感染率隨著宮頸病變程度級別的加重而呈上升趨勢；且HPV-16與宿主基因組的整合率在宮頸癌患者中高達68.8%，并且隨著宮頸病變程度的加重整合率出現明顯的提高，提示HPV-16感染與宮頸病變程度呈正相關，并且提示宮頸病變發生惡性轉化的過程中HPV-16整合狀態的存在是高危因素。

3.2 HPV-16整合感染與宮頸病變組織惡化之間的相關性以及作用機制

有研究表明，多數的HPV感染是一過性的，一般病毒會在感染后的6～12個月內消退。但是當在宿主的防御機制發生缺陷或者基因發生突變的時候，HPV病毒的基因片段則會與宿主發生改變的細胞基因組發生相關整合，因而導致細胞的基因調控機制出現失調的情況[10]。若HPV病毒的繁殖停止在復制周期的某一時相，就會發生HPV的持續感染，HPV特別是高危型HPV的持續性及反復性感染可能會導致宮頸細胞發生惡性轉化。有研究認為宮頸組織發生癌變的過程中的早期事件有可能就是HPV與宿主基因組發生整合[11-12]，但是關于其整合的具體的發生時相目前尚未有統一的結論，還需要進一步的研究討論。目前有研究表示在宿主宮頸病變組織中，HPV并非只是以單純的整合感染的狀態存在，因此HPV-16整合感染與宮頸病變組織惡化之間的相關性以及作用機制還需要進一步的研究。但是HPV-16作為惡化的高危因素，在預測宮頸癌前病變的轉歸上存在著一定預測作用。

3.3 HPV-16能夠提高宮頸癌初步篩選特異度

HPV DNA檢測方法是目前我國最普遍的宮頸癌初步篩選方法[3]，但不能發現HPV病毒基因是否與宿主基因組發生了整合感染[13]。在本次研究中，在CIN發生HPV-16感染的病例中就有22.3%發生HPV-16整合，即使在CINⅠ中整合率就有16.7%，說明高危HPV整合在宮頸病變的發生的早期中就有整合并且貫穿整個癌變過程。因此采用簡單、快速的HPV DNA檢測和高危HPV整合狀態的檢測，能夠提高宮頸癌初步篩選特異度。

綜上所述， HPV-16的整合感染可能導致宮頸病變惡化，在HPV DNA檢測的基礎上聯合對高危HPV整合感染狀態進行檢測有利于提高宮頸癌篩查特異度并在早期預測宮頸病變的轉歸。

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