鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和組織蛋白酶D表達水平及其與腫瘤侵襲轉移的關系分析

龔永謙，程愛蘭，劉 潔

(1.南華大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科，湖南衡陽 421001；2.南華大學醫學院病理學教研室，湖南衡陽 421001)

鼻咽癌是臨床常見惡性腫瘤，其侵襲性強，常因出現遠處轉移而危及患者生命安全，導致死亡等不良預后情況的發生[1-2]。因此，對鼻咽癌侵襲轉移進行評估干預對改善患者預后具有重要意義。癌癥的發生、發展涉及多個因子的影響，其中表皮生長因子受體(EGFR)參與調節細胞增殖、凋亡及血管形成，從而促進腫瘤的侵襲轉移；熱休克蛋白90A(HSP90A)可通過調控EGFR等基因影響腫瘤形成和發展，并促進其侵襲轉移；而組織蛋白酶D(cathepsin D)可通過催化、降解基底膜及細胞外基質促進腫瘤細胞移動和進入血液循環，從而促進腫瘤的侵襲轉移[3-4]。因此，EGFR、HSP90A和cathepsin D均可能與鼻咽癌的侵襲轉移相關，可能用于其侵襲轉移的評估與干預指導，并可能作為侵襲轉移干預的靶基因，目前關于此方向的研究甚少。本研究檢測了鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D表達情況，并分析其與腫瘤T分期、N分期及淋巴管密度(LVD)等的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2015年12月南華大學附屬第一醫院收治的60例鼻咽癌患者(A組)及同期30例鼻中隔偏曲患者(B組)。納入標準：A組患者均行病理活檢檢查，結合臨床表現和鼻咽部CT檢查，確診為鼻咽癌；B組確診為鼻中隔偏曲，行手術治療并取其正常鼻甲黏膜組織用于研究；兩組性別不限，年齡大于或等于18歲。排除標準：合并其他部位原發性腫瘤、轉移癌、免疫功能障礙及其他臟器嚴重疾病患者；哺乳期或妊娠期女性；精神異?；颊叩取Ｆ渲蠥組有1例因合并肺轉移排除，1例因妊娠期排除，最終納入58例，均為低分化鱗狀細胞癌；B組未排除患者，最終納入30例。本研究符合倫理學標準，經該院倫理委員會審核批準，患者均知情同意并簽署知情同意書。兩組患者性別、年齡、體質量指數(BMI)等基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2方法

1.2.1治療方法 A組鼻咽癌患者均常規進行同期放化療治療，B組采用鼻內鏡手術結合抗炎等藥物治療。

1.2.2EGFR、HSP90A和cathepsin D的檢測 采用免疫組織化學法檢測A組活檢鼻咽癌組織和B組鼻中隔偏曲的正常鼻甲黏膜組織EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達率，相關試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，具體操作如下：常規將活檢標本進行石蠟包埋后切成厚度為4 μm的連續切片，檢測前微波爐加熱后采用二甲苯液脫蠟處理3次；無水乙醇、95%和85%乙醇梯度脫水各5 min后流水沖洗3 min；檸檬酸工作液加熱煮沸15 min復原后采用7.2～7.4 pH值磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍；添加40 μL相應的一抗后室溫(20 ℃)孵育60 min，PBS洗滌3遍；添加40 μL相應的二抗后室溫(20 ℃)孵育30 min，PBS洗滌3遍。常規行二氨基聯苯胺(DAB)顯色，2 min后顯微鏡下觀察，顯色滿意后以清水終止反應；常規行蘇木素復染、返藍，無水乙醇脫水、吹干、中性樹脂封片觀察。隨機選取3個高倍區域(×200)進行觀察，cathepsin D表達定位于細胞質內，EGFR和HSP90A表達定位于細胞質或細胞膜，出現棕黃色、棕褐色或黃色顆粒判為表達陽性，由同一相關檢測經驗3年以上的醫師進行檢測和結果讀取。

1.2.3淋巴管密度(LVD)的檢測 統計患者的腫瘤T分期、N分期，采用D240抗體對活檢標本進行LVD檢測，操作嚴格參照試劑盒說明書進行，每份標本隨機選取5個高倍區域(×200)觀察記錄LVD，并取平均值為最終檢測結果。

2 結 果

2.1兩組EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達率比較 A組EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達率分別為86.21%、82.76%和87.93%，均高于B組(分別為30.00%、26.67%和33.33%)，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2鼻咽癌組織EGFR表達陽性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較 鼻咽癌組織EGFR蛋白表達陽性患者的腫瘤T3～T4分期百分比、N2～N3分期百分比及LVD均高于EGFR蛋白表達陰性患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 兩組EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達率比較[n(%)]

表3 鼻咽癌組織EGFR蛋白表達陽性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較

表4 鼻咽癌組織HSP90A蛋白表達陽性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較

表5 鼻咽癌組織cathepsin D蛋白表達陽性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較

2.3鼻咽癌組織HSP90A表達陽性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較 鼻咽癌組織HSP90A蛋白表達陽性患者的腫瘤T3～T4分期百分比、N2～N3分期百分比及LVD均高于HSP90A蛋白表達陰性患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

2.4鼻咽癌組織cathepsin D表達陽性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較 鼻咽癌組織cathepsin D蛋白表達陽性患者的腫瘤T3～T4分期百分比、N2～N3分期百分比及LVD均高于cathepsin D蛋白表達陰性患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

2.5鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D表達與其T分期、N分期及LVD的關系 Spearman相關分析結果顯示，鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D蛋白陽性表達率與其T分期、N分期及LVD均呈正相關(EGFR：r=0.844、0.795、0.785；HSP90A：r=0.862、0.825、0.822；cathepsin D：r=0.842、0.815、0.863，P<0.05)。

3 討 論

鼻咽癌為我國多發惡性腫瘤，近年來其發病率隨著生活方式和居住環境的改變而不斷增加，臨床發病率更是居于耳鼻喉科惡性腫瘤首位，對其進行及時有效的診治十分重要。鼻咽癌的發生部位為鼻咽部，其中咽隱窩、側壁、頂后壁較為常見，臨床可表現為涕中帶血、耳鳴、耳閉塞感等，且其侵襲轉移性強，可累及其他重要組織器官而嚴重危及患者健康和生命安全[5-6]。本研究亦分析了鼻咽癌的侵襲轉移情況，結果顯示，鼻咽癌T3～4分期患者比例高，N2～3分期患者比例高，LVD較高，鼻咽癌侵襲轉移發生率高，嚴重威脅人類健康和生命安全，對鼻咽癌侵襲轉移進行有效的防治具有重要意義。

腫瘤的發生、發展及侵襲轉移均涉及多個因子，而通過相關因子的檢測對鼻咽癌侵襲轉移進行評估干預，從而指導臨床干預，減少腫瘤侵襲轉移對預后造成的不良影響可能有助于其預后情況的改善。EGFR為與腫瘤侵襲轉移密切相關的因子，可通過參與調節細胞增殖、凋亡和促進腫瘤新生血管的形成而促進腫瘤的侵襲轉移[7-8]。HSP90A亦是與腫瘤密切相關的因子，可通過調控下游的EGFR等基因而影響腫瘤發生和發展[9]。cathepsin D則可催化和降解基底膜及細胞外基質，為腫瘤細胞移動和進入血液循環提供便利，從而促進腫瘤侵襲轉移[10-12]。因此，EGFR、HSP90A和cathepsin D均可能影響鼻咽癌侵襲轉移，然而目前關于此方向的研究仍較少。因此，本研究分析了鼻咽癌患者腫瘤組織EGFR、HSP90A和cathepsin D表達情況及其與腫瘤T分期、N分期及LVD等侵襲轉移指標的關系。

本研究結果顯示，鼻咽癌組織的EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達率均在80%以上，遠高于正常鼻甲黏膜組織陽性表達率(約30%)，提示EGFR、HSP90A和cathepsin D均可能與鼻咽癌的發生、發展相關。且本研究中鼻咽癌組織EGFR、HSP90A、cathepsin D蛋白表達陽性患者的腫瘤T3～4分期百分比、N2～3分期百分比及LVD均高于相應蛋白表達陰性患者，提示鼻咽癌組織的EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達率可能與其腫瘤T分期、N分期及LVD等侵襲轉移指標相關。進一步的Spearman相關分析結果顯示，鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達率與其T分期、N分期及LVD均密切相關，鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達患者需確定其侵襲轉移的發生，及時發現腫瘤侵襲轉移并進行干預，減少腫瘤侵襲轉移對預后造成的不良影響，而采取措施抑制EGFR、HSP90A和cathepsin D表達可能有助于鼻咽癌腫瘤侵襲轉移的預防和治療，這需要進一步研究探討。

綜上所述， 鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D陽性表達率高且與腫瘤侵襲轉移密切相關，可能用于鼻咽癌腫瘤侵襲轉移的評估，指導臨床進行鼻咽癌腫瘤侵襲轉移的防治，且EGFR、HSP90A和cathepsin D可能作為鼻咽癌基因治療的靶基因。

[1]陳順金，陳靖，吳笑英，等．鼻咽癌EGFL7的表達與腫瘤侵襲轉移的關系[J]．海南醫學，2016，27(16)：2618-2620．

[2]THOMPSON L D，PENNER C，HO N J，et al．Sinonasal tract and nasopharyngeal adenoid cystic carcinoma:a clinicopathologic and immunophenotypic study of 86 cases[J]．Head Neck Pathol，2014，8(1)：88-109．

[3]CARPENTER B L，CHEN M，KNIFLEY T，et al．Integrin α6β4 promotes autocrine epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling to stimulate migration and invasion toward hepatocyte growth factor (HGF)[J]．J Biol Chem，2015，290(45)：27228-27238．

[4]SNIGIREVA A V，VRUBLEVSKAYA V V，SKARGA Y Y，et al．Effect of heat shock protein 90 (Hsp90) on migration and invasion of human cancer cells in vitro[J]．Bull Exp Biol Med，2014，57(4)：476-478．

[5]王園園，賀秋艷，易紅梅，等．RKIP在鼻咽癌侵襲轉移中的作用及機制研究[J]．臨床與病理雜志，2015，35(3)：375-381．

[6]SANG Y，CHEN M Y，LUO D，et al．TEL2 suppresses metastasis by down-regulating SERPINE1 in nasopharyngeal carcinoma[J]．Oncotarget，2015，6(30)：29240-29253．

[7]POSCHAU M，DICKREUTER E，SINGH-MüLLER J，et al．EGFR and β1-integrin targeting differentially affect colorectal carcinoma cell radiosensitivity and invasion[J]．Radiother Oncol，2015，116(3)：510-516．

[8]DA ROSA M R，FALCO A S，FUZII H T，et al．EGFR signaling downstream of EGF regulates migration,invasion,and MMP secretion of immortalized cells derived from human ameloblastoma[J]．Tumour Biol，2014，35(11)：11107-11120．

[9]王亞飛．組織蛋白酶D在鼻咽癌細胞中相互作用蛋白的篩選與鑒定[D]．衡陽：南華大學，2014．

[10]PRANJOL M Z，GUTOWSKI N，HANNEMANN M，et al．The potential role of the proteases cathepsin D and cathepsin L in the progression and metastasis of epithelial ovarian cancer[J]．Biomolecules，2015，5(4)：3260-3279．

[11]王亞飛．Cathepsin D與惡性腫瘤的關系[J]．腫瘤基礎與臨床，2014，27(1)：79-81．

[12]BACH A S，DEROCQ D，LAURENT-MATHA V，et al．Nuclear cathepsin D enhances TRPS1 transcriptional repressor function to regulate cell cycle progression and transformation in human breast cancer cells[J]．Oncotarget，2015，6(29)：28084-28103．