基于miR-1285在卵巢癌組織中的表達及對癌細胞增殖和凋亡的影響

李 娜，熊 姣，王東紅

(遵義醫學院附屬醫院婦科，貴州遵義 563003)

微RNAs(microRNAs，miRNAs)是一種小分子非編碼RNA，由20～25個核苷酸組成[1]。miRNAs最早于1993年在真核生物中被發現，后續的研究表明其能通過堿基互補配對與目的基因mRNA的5′端或3′端相結合，介導目的基因mRNA的降解或者抑制其與轉錄因子的結合而降低目的基因mRNA的翻譯過程，miRNAs通過其基因調控的功能，廣泛參與真核生物細胞內多種生物過程，包括細胞信號的傳導、細胞增殖與分化、細胞周期的調控等，同時也與多種腫瘤的發生、發展過程密切相關，因此對于miRNAs在生物體生長發育及癌癥中的研究已成為生命科學領域研究的重點[2-5]。早期已有研究表明，miRNA-1285(miR-1285)在組織中的異常表達可能和多種類型的腫瘤發生密切相關，如胰腺癌、肝癌等[3-5]。為探討miR-1285的表達水平在卵巢癌發生、發展過程中的作用，筆者利用熒光定量PCR的方法檢測miR-1285在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達，分析其與癌癥發生的關系；同時運用體外細胞培養實驗，觀察miR-1285在人源的卵巢癌細胞(SKOV3、OVCAR3)增殖和凋亡過程中的作用，為探討其在卵巢癌發生、發展過程中的分子機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 選取40例2014年9月至2015年9月來本院婦科就診的卵巢癌患者組織切片標本，包括卵巢癌組織切片及對應癌旁組織切片，癌組織是指取自患者卵巢癌組織區域的細胞，癌旁組織是指在患者卵巢癌組織周圍未發生壞死或癌變的正常卵巢組織細胞。本研究經本院倫理委員會審核批準，參與此次研究的所有患者均簽署知情同意書，且均在術前3個月未接受任何關于抗癌治療的藥物或其他相關性治療的手段。

1.1.2細胞株及試劑 兩株人源的卵巢癌細胞株(SKOV3、OVCAR3)購自中科院上海細胞庫；RPMI-1640細胞培養基(貨號：SH30809)、DMEM培養基(貨號：SH30033)、胎牛血清(FBS，貨號：SH30084)、0.25%的胰酶消化液(貨號SH30042)及10×磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號：SH30256))均購自美國Hycolone公司；TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(貨號：4366596)、TaqMan?Universal PCR Master Mix(貨號：4324018)均購自美國ABI公司；Lipofectamine?2000 Transfection Reagent(貨號：11668027)購自美國Invitrogen公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：556547)購自美國BD公司；噻唑藍(MTT，貨號：M2128)購自美國Sigma 公司；TRIzol試劑(貨號：15596-026)購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染 (1)細胞復蘇：首先取出凍存的兩株人源卵巢癌細胞(SKOV3、OVCAR3)，迅速放置于37 ℃水浴鍋中融化，然后四度低速(300 r/min)離心3 min，棄去上清液，加入1 mL含有10% FBS的RPMI-1640培養液將細胞重懸，然后置于培養皿中，放入含有5% CO2的37 ℃培養箱進行培養，當生長至合適的細胞密度(70%～80%)時，對其進行傳代培養。(2)細胞轉染：其中miR-1285 mimics及mimics control均在生工生物進行合成(表1)，細胞轉染嚴格按照美國Invitrogen公司的Lipofectamine?2000 Transfection Reagent說明書進行操作。

1.2.2卵巢癌細胞系全RNA的抽提 對轉染48 h后的卵巢癌細胞經0.25%胰酶消化，收集消化后的細胞懸液于15 mL離心管中；進行4 ℃低速(1 000 r/min)離心2 min，棄去上清液，置于冰上；加入1 mL Trizol裂解液，重懸并混勻細胞，置于冰上；向Trizol裂解液中加入200 μL氯仿，劇烈震蕩細胞懸液，室溫放置5～10 min，然后采用四度，12 000 r/min離心15 min；取離心之后的上層水相，于RNase-free的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇，充分震蕩混勻后，于冰上放置30～40 min；取出離心管，然后再四度，12 000 r/min離心15 min，得到RNA沉淀；采用500 μL 75%乙醇對RNA沉淀進行兩次洗滌，然后風干；加入50 μL RNase-free的水，室溫溶解RNA；采用NanoDrop對總抽提的RNA進行濃度測定，置于-20 ℃備用。

表1 miR-1285 mimics與mimics control的序列信息

1.2.3RNA的反轉錄及熒光定量PCR 按照美國ABI公司的TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription試劑盒操作說明書，對抽提的RNA進行體外反轉錄實驗，得到Cdna產物；反應條件為：16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min，4 ℃保存。以得到的cDNA為模版，進行熒光定量PCR，采用TaqMan?Universal PCR Master Mix 20 μL反應體系，在羅氏LightCycler480儀器上操作，以U6作為表達檢測的內參，ΔCT表示miR-1285的相對表達，其中ΔCT=|CTmiR-1285-CTU6|；反應條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s進行40個循環的擴增。

1.2.4癌細胞增殖活力的MTT檢測 首先對消化后的卵巢癌細胞進行血小板計數，然后將轉染miR-1285 mimics及mimics control的細胞接種到96孔培養板上，其中每孔接種約5×103個細胞；在含5%CO2的37 ℃培養箱進行一段時間的培養后(分別是0、24、48、72 h)，加入20 μL 5 mg/L MTT，放入培養箱繼續培養4 h；取出96孔培養板，將每孔中的液體吸出并加入120 μL二甲基亞砜進行溶解；混合均勻后，通過酶標儀檢測其在570 nm處的吸光值(A570)，以反映細胞增殖能力的強弱。

1.2.5癌細胞凋亡率的檢測 將轉染miR-1285 mimics及mimics control 24 h后的人源卵巢癌細胞取出，更換其培養液為不含FBS的無血清培養液，并將培養皿置于37 ℃，含低濃度CO2(1% CO2)的環境中，將卵巢癌細胞繼續培養至48 h；然后通過100 μL 0.25%胰酶對貼壁的細胞進行消化，收集細胞于1.5 mL離心管中，并在避光環境中依次加入5 μL Annexin V、5 μL PI，充分混勻后，在避光環境中室溫孵育20 min，然后對細胞進行流式細胞儀分選檢測。

2 結 果

2.1卵巢癌組織中miR-1285的表達水平 以癌細胞的U6作為內對照，對卵巢癌組織及對應癌旁組織中miR-1285的相對表達水平進行定量分析發現，相較于癌旁組織(5.41±1.25)，卵巢癌組織細胞中miR-1285 表達水平(2.73±1.04)較低，差異有統計學意義(t=10.42，P<0.05)。

2.2轉染miR-1285 mimics后人卵巢癌細胞的增殖活性 根據轉染人源卵巢癌細胞系SKOV3、OVCAR3的情況不同，依次分為轉染組(轉染miR-1285 mimics)、陰性對照組(轉染mimic control)和空白對照組(未轉染任何microRNA)。在轉染后的4個時間段(0、24、48、72 h)，每個時間點取15份平行設置的細胞樣品進行觀察，對細胞采用MTT法檢測其A570值。結果表明，在SKOV3細胞系中，轉染組的A570值在24 h之后明顯低于陰性對照組與空白對照組(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組在4個時間點處的A570值比較,差異無統計意義(P>0.05)，見表2；在OVCAR3細胞系中，轉染組的細胞其A570值在48 h之后明顯低于陰性對照組與空白對照組(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組在4個時間點處的A570值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 SKOV3細胞系在各個時間點處的A570值(n=15,±s)

*:P<0.05，與轉染組比較

表3 OVCAR3細胞系在各個時間點處的A570值變化(n=15,±s)

*:P<0.05，與轉染組比較

圖2 OVCAR3細胞系流式分選結果

2.3轉染miR-1285 mimics后促進人卵巢癌細胞凋亡 對轉染miR-1285 mimics 48 h后的細胞進行流式細胞分選發現(圖1)，SKOV3細胞系的凋亡率升高，明顯高于轉染mimic control的陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；而陰性對照組的細胞凋亡率與空白對照組無明顯差異(P>0.05)，見表4。在OVCAR3細胞系中(圖2)，轉染miR-1285 mimics 48 h后，細胞的凋亡率也升高，明顯高于轉染mimic control的陰性對照組細胞，差異有統計學意義(P<0.05)，而陰性對照組的細胞凋亡率則與空白對照組無明顯差異(P>0.05)，見表4。

表4 細胞凋亡率的比較(n=15,±s，%)

*:P<0.05，與轉染組比較

3 討 論

卵巢癌在女性生殖系統中發病率較高，屬于常見惡性腫瘤，約占女性生殖系腫瘤的三分之一，其發病十分隱匿，對患者的早期診斷造成了較大的困難，臨床上被診斷為卵巢癌的患者70%以上已發生了盆腔等多處組織的轉移，導致其5年生存率低于30%[6]。臨床上關于卵巢癌的發病病因還不是十分清楚，其病理也較為復雜，缺少有效的治療手段，目前還未有明確的臨床指標可對卵巢癌的診斷及治療提供參考[7]。因此，對卵巢癌發病機制的研究顯得尤為關鍵。miRNAs是一類存在于細胞內，長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，自從20世紀90年代LEE等[5]在真核生物中發現了第一個miRNA(Lin4)之后，學者們對miRNAs進行了一系列的后續研究，發現miRNAs通過堿基互補配對，與其靶基因結合，可調控基因的表達，從而參與細胞的增殖和分化[8]。在對癌癥細胞的研究中發現，miRNAs在癌癥的發生、發展中起著十分重要的作用，其通過調控靶基因的表達，參與細胞內信號通路的傳導，參與細胞周期的調控，介導細胞的凋亡過程等[9]。有研究報道，通過利用miRNA芯片技術，分別檢測人源卵巢癌細胞系及正常卵巢上皮細胞中miRNAs的表達譜發現，一共檢查到173個miRNAs的表達，其中在兩種細胞系中共同表達的miRNAs共160個，有35個miRNAs表達差異有統計學意義(P<0.05)，其中表達下調的miRNAs有31個，表達上調的miRNAs有4個，在這4個下調的miRNAs中，包含兩個具有抑制腫瘤發展的miRNAs，分別是let-7d與miRNA-127，暗示著miRNAs與卵巢癌的發生有一定的相關性[10]。有學者對106例卵巢癌患者進行分期，即早期組卵巢癌和晚期組卵巢癌患者，采用基因芯片技術檢測卵巢癌組織中miRNAs的表達，發現兩組存在44個miRNAs基因的表達差異，且在晚期卵巢癌患者中表達均下調，包括具有腫瘤抑制功能的miR34a及miR15a等，表明在卵巢癌的發展過程中miRNAs起著重要的作用[11]。

本研究發現，miR-1285與卵巢癌的發生十分相關，其在卵巢癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織；除此之外，細胞學實驗證明，miR-1285的表達升高，會致使癌細胞的增殖能力明顯下降，同時導致癌細胞的凋亡率明顯升高，表明miR-1285與卵巢癌的發生、發展過程密切相關，miR-1285可能作為卵巢癌細胞中的抑癌因子，在癌細胞的凋亡過程中發揮功能。分析其發揮功能的可能機制：有研究發現在胰腺癌中miR-1285與相關蛋白結合，以miRNA誘導沉默復合體(miRISC)蛋白復合體的形式與靶基因YAP1的mRNA相結合，在轉錄水平抑制其翻譯過程，從而達到抑癌的作用[12]；另有研究報道，miR-34c與miR34b通過調控靶基因P53的轉錄，導致卵巢癌的發生[13]；miR214則通過負調控第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源物基因(PTEN)的表達，參與蛋白激酶B(AKT)通路，從而在卵巢癌的轉移過程中起作用[14]；miR-210通過對靶基因組織缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的調控，參與腫瘤轉移時血管的生成[15]。

綜上所述，miRNAs通過調控不同的靶基因參與卵巢癌的發生、發展過程。本文通過對40例卵巢癌患者的研究發現，miR-1285與卵巢癌的發生、卵巢癌細胞的增殖及凋亡密切相關，表明其在卵巢癌發生、發展中起著重要作用，但是至于該過程中的具體分子機制，還有待進一步的探索。本研究為了解miR-1285與卵巢癌發生的關系奠定了一定的理論基礎和實驗依據。

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