胃癌微環(huán)境中M2亞型巨噬細胞對胃癌間充質(zhì)干細胞促腫瘤作用的影響

孫召東，張 婷，霍 娟，李 偉△

(江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.中心實驗室 222001)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國每年新增胃癌患者數(shù)量高達40多萬，其發(fā)病率及病死率在腫瘤相關(guān)疾病中排第3位[1]。針對胃癌發(fā)生、發(fā)展機制的研究也因此備受我國學者的關(guān)注。目前，腫瘤微環(huán)境對胃癌的影響已成為研究熱點之一[2-3]。其中，間質(zhì)干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)與巨噬細胞等微環(huán)境細胞之間的相互作用對胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響引起了科學家們的廣泛興趣。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織來源的MSCs(gastric cancer-derived MSCs，GC-MSCs)對胃癌細胞的增殖、遷移及促血管生成能力具有明顯的促進作用，且該作用與非腫瘤組織來源的MSCs，如胃癌癌旁組織來源的MSCs(GCN-MSCs)、骨髓來源的MSCs(BM-MSCs)相比更強[4]。然而，GC-MSCs發(fā)揮促胃癌作用的機制尚不清楚。大量研究證實，MSCs具有誘導巨噬細胞極化的作用，而M2亞型巨噬細胞已被證實可明顯促進腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[5-6]。為此，本研究旨在探討胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤組織內(nèi)M2亞型巨噬細胞對GC-MSCs促胃癌效應的影響，并通過體外研究驗證GC-MSCs誘導胃癌微環(huán)境巨噬細胞向M2亞型極化的調(diào)節(jié)作用，為研究胃癌的發(fā)病機制提供更多的理論依據(jù)，并為胃癌的臨床治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 留取本院胃癌切除手術(shù)患者新鮮胃癌及癌旁組織(距癌變部位5 cm以上，病理檢查無癌組織)，取材均取得患者家屬同意并簽署知情同意書。所有患者術(shù)前均未接受任何放化療，術(shù)后經(jīng)病理確診為胃腺癌。

1.1.2主要儀器與試劑 L-DMEM營養(yǎng)液、RPMI1640營養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；氯磷酸鹽脂質(zhì)體(clodronate liposome，lipo-MBP)和對照(PBS liposome，lipo-PBS)(荷蘭Nicovan Rooijen公司)；佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA,美國Sigma-Aldrich公司)；Transwell板(美國Corning公司)；兔抗小鼠F4/80抗體和羊抗小鼠Ki67抗體(英國Abcam公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Roche Diagnostics公司)；PCR試劑盒(日本Takara公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；NanoDrop-2000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；PCR儀(Veriti 96)(美國Applied Biosystems公司)；全自動凝膠成像儀(北京吉諾思科貿(mào)公司)。

1.2方法

1.2.1巨噬細胞體內(nèi)清除 lipo-MBP或lipo-PBS分別按照100 μL/10 g小鼠體質(zhì)量的劑量經(jīng)尾靜脈注射，以清除體內(nèi)單核/巨噬細胞，每4天注射1次，直至實驗觀察期結(jié)束(14 d)。

1.2.2裸鼠皮下致瘤實驗 選取3～4周齡雌性BALB/c裸鼠共20只，均購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院[生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2015-0001]。所有實驗動物均于本院神經(jīng)醫(yī)學研究所動物中心飼養(yǎng)，并分為4組：lipo-PBS+BGC-823組、lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組、lipo-MBP+BGC-823組及l(fā)ipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組。皮下接種細胞14 d后，脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織，記錄其質(zhì)量與體積后進行組織學分析。

1.2.3免疫組織化學法 將裸鼠皮下致瘤瘤體浸泡于中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，經(jīng)抗原修復處理后，依次加入Ki67抗體及生物素標記的二抗后孵育并顯色。倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。結(jié)果判定標準：棕黃色顆粒顯像為Ki67表達陽性反應。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 法 收集lipo-PBS+BGC-823組和lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組裸鼠致瘤組織5對及胃癌患者癌與癌旁組織3對，TRIzol裂解后抽提組織來源總RNA。此外，采用20 ng/mL PMA刺激人單核細胞株THP-1分化為巨噬細胞后，將其與GC-MSCs進行體外共培養(yǎng)。72 h后，收集各處理組細胞并以TRIzol裂解抽提總RNA。小鼠iNOS、Ym-1和β-actin引物，人iNOS、Ym-1、Fizz-1和β-actin引物采用Primer Software軟件進行設(shè)計(表1)。利用NanoDrop-2000分光光度計對總RNA的純度和含量進行檢測。根據(jù)試劑盒提供的方案，以Superscript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶在40 μL反應體系內(nèi)對3 μg總RNA進行cDNA合成。25 μL PCR反應混合體系中分別含有Premix Ex Taq 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL 及2 μL cDNA模板。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；退火溫度(Tm)30 s，72 ℃ 30 s,25～35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測 收集小鼠及胃癌患者腫瘤組織，裂解液冰上提取蛋白。此外，將THP-1分化來源巨噬細胞與GC-MSCs進行72 h體外共培養(yǎng)，收集各處理組細胞并以裂解液冰上提取蛋白。取等量蛋白，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%(質(zhì)量/體積)脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗[抗Arginase-1、趨化因子受體-2(CCR-2)和β-actin]后，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，加入電化學發(fā)光(ECL)試劑顯色。全自動化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測并分析Western blot結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1巨噬細胞對GC-MSCs促胃癌效應的影響 裸鼠皮下致瘤實驗結(jié)果表明， lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤體積及質(zhì)量均明顯高于lipo-PBS+BGC-823組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009、0.001)，見圖1。采用lipo-MBP清除裸鼠體內(nèi)單核/巨噬細胞后發(fā)現(xiàn)，lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組的腫瘤體積及質(zhì)量與lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組相比明顯減小(P=0.028、0.009，圖1)，體內(nèi)清除巨噬細胞顯著抑制了GC-MSCs的促胃癌效應。然而，lipo-PBS+BGC-823組和lipo-MBP+BGC-823組裸鼠皮下致瘤能力相比，差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.251、0.175，圖1)。

2.2巨噬細胞對胃癌組織中腫瘤細胞增殖能力的影響 裸鼠腫瘤組織蘇木素-伊紅(HE)染色結(jié)果顯示，lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤病理組織學惡性程度最高，而給予巨噬細胞清除的lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤惡性程度則明顯降低(圖2)。腫瘤組織Ki67免疫組織化學結(jié)果顯示，lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組棕黃色陽性細胞數(shù)量明顯高于lipo-PBS+BGC-823組，而體內(nèi)清除巨噬細胞后lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組裸鼠腫瘤組織中Ki67陽性增殖細胞數(shù)量較lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組明顯減少(圖2)。此外，lipo-PBS+BGC-823組和lipo-MBP+BGC-823組胃癌組織中Ki67陽性細胞數(shù)量并無明顯差異，見圖2。

2.3裸鼠致瘤組織中M2亞型巨噬細胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及表達情況 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，GC-MSCs共注射組腫瘤組織中iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于BGC-823單獨注射組；相反，M2亞型巨噬細胞相關(guān)基因Ym-1在GC-MSCs共注射組腫瘤組織中顯著高表達，見圖3A。Western blot檢測結(jié)果表明，M2亞型巨噬細胞主要的兩種相關(guān)蛋白精氨酸酶(Arginase-1)和CCR-2在GC-MSCs共注射組中的表達水平均明顯高于BGC-823單獨注射組，見圖3B。

表1 巨噬細胞M2亞型相關(guān)基因擴增上下游引物

A：BGC-823細胞皮下注射14 d后裸鼠致瘤情況；B：不同處理組腫瘤組織質(zhì)量(n=5)；C：不同處理組腫瘤組織體積(n=5)；*：P<0.01；#：P<0.05

圖1巨噬細胞清除對GC-MSCs促胃癌能力的影響

圖2 不同處理組裸鼠致瘤組織HE染色及Ki67免疫組織化學染色(×200)

A：RT-PCR檢測結(jié)果；B：Western blot檢測結(jié)果

圖3 M2亞型巨噬細胞相關(guān)基因在裸鼠腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄及表達情況

2.4胃癌患者腫瘤組織中M2亞型巨噬細胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及表達情況 本研究選擇并觀察了3例臨床胃癌患者癌及對應癌旁組織中M2亞型巨噬細胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、表達情況，由此判斷M2亞型巨噬細胞與GC-MSCs的組織學定位相關(guān)性。RT-PCR結(jié)果顯示，M1亞型巨噬細胞相關(guān)基因iNOS在3例患者癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于癌組織，而Ym-1在3例癌組織中的轉(zhuǎn)錄均明顯高于對應癌旁組織，見圖4A。Western blot檢測結(jié)果也表明，M2亞型巨噬細胞相關(guān)蛋白Arginase-1和CCR-2在癌組織中表達水平高于對應癌旁組織，見圖4B。

A：RT-PCR檢測結(jié)果；B：Western blot檢測結(jié)果

圖4 M2亞型巨噬細胞相關(guān)基因在胃癌患者癌及癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄及表達情況

2.5GC-MSCs體外共培養(yǎng)對巨噬細胞向M2亞型轉(zhuǎn)換的影響 本研究分別采用間接與直接接觸共培養(yǎng)實驗評價了GC-MSCs對巨噬細胞亞型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用。培養(yǎng)72 h后RT-PCR結(jié)果顯示，GC-MSCs與巨噬細胞直接接觸共培養(yǎng)后其M2亞型巨噬細胞相關(guān)基因Ym-1、Fizz-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對照組，見圖5A。此外，巨噬細胞中Arginase-1和CCR-2蛋白的表達水平在GC-MSCs與巨噬細胞直接接觸共培養(yǎng)后也明顯升高，見圖5B。

A：RT-PCR檢測結(jié)果；B：Western blot檢測結(jié)果

圖5 GC-MSCs對巨噬細胞亞型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用

3 討 論

大量研究表明，基質(zhì)細胞通過為腫瘤細胞提供有利微環(huán)境而在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。HASHIMOTO等[8]研究報道，巨噬細胞和BM-MSCs可被募集入神經(jīng)母細胞瘤局部并分別活化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞及癌相關(guān)成纖維細胞，從而為癌癥的發(fā)生、發(fā)展提供有利的微環(huán)境。同時，MSCs、巨噬細胞與腫瘤細胞三者之間的相互作用也已被證實在多種不同腫瘤的發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。YANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞活化后的BM-MSCs可獲得促炎表型，且通過核因子-κB(NF-κB)信號通路的活化而促進胃癌細胞增殖與遷移。CHATURVEDI等[10]則指出，三陰性乳腺癌細胞與MSCs之間可通過缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)依賴的信號通路相互作用，從而促進巨噬細胞向原發(fā)性乳腺腫瘤局部的遷移富集。然而，腫瘤微環(huán)境局部MSCs、巨噬細胞與腫瘤細胞之間的相互調(diào)節(jié)，尤其基質(zhì)細胞MSCs與腫瘤相關(guān)巨噬細胞之間的相互作用及其對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響尚有待深入研究。

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，同時也是一類典型的炎癥相關(guān)性腫瘤。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，GC-MSCs通過分泌大量白細胞介素-8(IL-8)發(fā)揮較強的促胃癌作用[4]。盡管如此，GC-MSCs促腫瘤作用的機制，尤其是GC-MSCs與其他基質(zhì)細胞之間的相互作用對胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響尚無報道。ZHU等[11]研究指出，GC-MSCs與中性粒細胞之間的相互作用促進了胃癌細胞的侵襲及促血管生成能力，進而促成了癌細胞的轉(zhuǎn)移性播散。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在GC-MSCs的體內(nèi)促胃癌效應中發(fā)揮必不可少的作用，清除巨噬細胞后裸鼠體內(nèi)腫瘤生長明顯受到抑制。REN等[12]認為，淋巴瘤組織來源的MSCs(lymphoma-derived MSCs，L-MSCs)可明顯促進腫瘤生長，同時在體內(nèi)實驗中進一步證實了單核/巨噬細胞(而非中性粒細胞)介導了L-MSCs的促腫瘤效應。這一結(jié)論與本研究是一致的。因此，深入研究腫瘤微環(huán)境中MSCs與巨噬細胞之間的相互作用將為闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制提供更多的信息。

目前，腫瘤基質(zhì)中浸潤的巨噬細胞已被證實在腫瘤組織維持自身穩(wěn)定及生長的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。它們主要分為經(jīng)典活化的巨噬細胞(M1)及替代活化的巨噬細胞(M2)兩種不同亞型。其中，M2亞型巨噬細胞可促進腫瘤增殖并與多種不同腫瘤的預后不良密切相關(guān)。盡管如此，腫瘤組織中M2亞型巨噬細胞產(chǎn)生的機制尚不清楚。MATHEW等[14]研究了胰腺癌組織來源的MSCs，并證實該MSCs促腫瘤生長的作用與其誘導巨噬細胞向M2亞型極化密切相關(guān)。本研究中，聚集了GC-MSCs細胞的人、小鼠胃癌組織被檢測出較高比例的M2亞型巨噬細胞。此外，在GC-MSCs與巨噬細胞的體外共培養(yǎng)實驗中，進一步發(fā)現(xiàn)GC-MSCs直接接觸培養(yǎng)的巨噬細胞中M2亞型相關(guān)基因Ym-1、Fizz-1的mRNA轉(zhuǎn)錄及Arginase-1和CCR-2蛋白的表達水平均顯著增高，初步證實GC-MSCs促進巨噬細胞從M1向M2亞型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，胃癌微環(huán)境中M2亞型巨噬細胞參與了GC-MSCs的促腫瘤效應。同時，腫瘤基質(zhì)中GC-MSCs對巨噬細胞由M1向M2亞型的極化過程具有調(diào)節(jié)作用。可見，GC-MSCs與巨噬細胞之間的相互作用推進了胃癌發(fā)生、發(fā)展的進程，有望為臨床靶向治療提供更多的理論指導。

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