不同脫蠟劑對實時熒光定量PCR檢測石蠟塊EGFR基因突變結果的影響

徐 帆

(重慶三峽中心醫院病理科 40400)

表皮生長因子受體基因(EGFR基因)是非小細胞肺癌((NSCLS)高頻驅動基因，先檢測、后治療的NSCLS靶向個體化治療模式已成為臨床診療規范。所有接受EGFR靶向酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TK1)治療的患者都需要接受EGFR分子檢測。病理科所開展的石蠟塊EGFR基因突變檢測法是利用活檢組織脫水后制成的石蠟塊進行的DNA提取，然后實時熒光定量PCR分析結果，極大地方便了患者，但需確保敏感性和特異性。質量保證和質量控制是關鍵環節，其中重要的環節包括石蠟塊的DNA提取[1]，檢測中的設備、試劑及實驗室的檢測環境。目前所有試劑公司在DNA提取的操作規范說明書中均要求對石蠟塊切片脫蠟處理時使用二甲苯，但二甲苯具有極強的揮發性，對人體健康有影響。美國勞工部的職業安全與衛生管理處規定二甲苯的安全空氣濃度在100 ppm以下，而目前分子實驗室的工作環境超出了此安全范圍。彌散在空氣中的二甲苯可以通過呼吸道吸入或皮膚黏膜接觸進入人體，損傷神經系統和血液系統，導致慢性中毒癥狀。對于空氣要求極其嚴格的分子實驗室環境污染大，我國已將二甲苯中毒定為職業病。有研究報道，松節油在病理蘇木素-伊紅(HE)制片的各個環節均能替代二甲苯，起到很好的效果[2-4]，而石蠟塊EGFR基因突變檢測中石蠟切片DNA提取過程中的脫蠟與HE制片中原理一致。本研究旨在尋找一種既能不影響實時熒光定量PCR結果分析，又能不污染實驗室工作環境的方法[5-6]，以確保各個環節的質控，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 從2014年11月起，連續6個月收集本院病理科石蠟標本切片68份，均分成A組(二甲苯脫蠟)和B組(松節油脫蠟)進行石蠟塊EGFR基因突變檢測。DNA提取試劑盒由QIAGEN生物工程有限公司提供，EGFR突變檢測試劑盒由上海源奇生物公司提供，CObasZ480型PCR擴增儀器由羅氏公司提供。

1.2方法

1.2.1石蠟切片制作及脫蠟 標本均經4%中性甲醛固定，常規取材，脫水，石蠟包埋，6 μm厚切片10～15片。將石蠟切片放入1.5 mL離心管中，A組加入1.0 mL二甲苯，B組加入1.0 mL松節油，蓋緊并劇烈震蕩混勻10 s，然后將標本置于56 ℃水浴中10 min脫蠟，室溫(15～25 ℃)下13 200×g離心5 min,吸取上清液丟棄。A組再加入1.0 mL二甲苯，B組再加入1.0 mL松節油，重復上述步驟2～3次，最后1次脫蠟離心10 min(大標本脫蠟2～3次，小標本脫蠟2次)。之后操作步驟嚴格按QIAGEN試劑盒及上海源奇試劑盒說明書進行。

1.2.2熒光定量PCR檢測 擴增條件：42 ℃ 5 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s；60 ℃ 80 s，共40個循環，反應體系共25 μL。在PCR循環第2步60 ℃時收集熒光信號。檢測通道為：FAM，參比熒光設定為none。(1)基線的確定：軟件默認為3～15個循環的平均熒光信號為基線。在實驗中，一般選擇曲線波動較小，較穩定的片段作為基線，可根據實際情況自行酌情調整。終點避免覆蓋信號已經開始有明顯增長的地方，且以起點與終點間間隔8個循環以上為原則。(2)閾值的確定：在陰性對照無擴增的情況下，以閾值設定在無典型擴增曲線樣本的最高點，且陰性對照未檢出為原則，確定起始閾值。(3)不同的反應液應分別單獨確定各自的基線和閾值后，再進行各自分析。

1.2.3實驗初期為了確保每次實驗的客觀性及準確性，每份標本都送上海源奇生物公司總部實驗室進行印證實驗，結果均相符合。本實驗室也在2016年參加了病理質控評價中心(PQCC)分子病理室間質控石蠟塊EGFR的檢測，順利通過質評并獲得PQCC室間質評證書。

2 結 果

本研究實驗中檢測時均設立了外部質控和內質控(內參)。外部質控包含陽性及陰性對照，檢測結果外部質控的陽性及陰性對照均符合要求；內質控(內參)均在有效范圍內，顯示檢測過程規范、合理、有效。接收的同一標本檢測相同的靶點時A、B對照組選取規則的擴增曲線為有效的(疑似陽性標本)讀取其CT值，作為對照比較；不規則的擴增曲線為無效的作為陰性處理，不作為對照分析。68份標本中,每份標本A、B兩組內質控(內參)CT值均有效，差值均小于0.99，見表1、圖1。

表1 檢測結果有效性判定(n=68)

圖1 A、B組內質控(內參)擴增曲線比較

A：18號檢測靶點；B：19號檢測靶點；C：21號檢測靶點

圖2 A、B組各檢測靶點擴增曲線比較

在相同切片標本的18號檢測靶點中，A、B兩組均有3份疑似陽性標本，兩組擴增曲線CT值之差均小于0.99；結合內質控(內參)CT值分析，最終結果判定1份切片標本A、B兩組均為陽性，2份切片標本A、B兩組均為陰性。在相同切片標本的19號檢測靶點中，A、B兩組均有7份疑似陽性標本，兩組擴增曲線CT值之差均小于0.99；結合內質控(內參)CT值分析，最終結果判定3份切片標本A、B兩組均為陽性，4份切片標本A、B兩組均為陰性。在相同切片標本的21號檢測靶點中，A、B兩組均有11份疑似陽性標本，兩組擴增曲線CT值之差均小于0.99；結合內質控(內參)CT值分析，最終結果判定6份切片標本A、B兩組均為陽性，5份切片標本A、B兩組均為陰性。本研究中只檢測到18、19、21這3個靶點的陽性結果進行比對，其他的3個靶點未檢測到陽性結果。最終結果分析表明同一份切片標本分為A、B兩組經不同的脫蠟劑處理后同時實時熒光定量PCR分析，結果無差異，陽性及陰性結果判定相符。A、B組各檢測靶點擴增曲線比較，見圖2。

3 討 論

EGFR基因共28個外顯子，其中編碼酪氨酸激酶的是第18～21號外顯子。關于EGFR基因突變的研究表明，盡管突變部位分散整個酪氨酸激酶編碼區，但絕大多數突變集中在第19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R點突變。本實驗使用的EGFR突變檢測試劑盒由上海源奇生物公司提供，檢測18、19、20、21、S768I、T790M，共6個靶點，方法簡便、快速、準確。進行EGFR基因突變檢測時，本研究將每份石蠟切片分入A、B兩組，分別用二甲苯和松節油脫蠟處理后[7]，同時進行實時熒光定量PCR擴增，探討兩組擴增曲線的差異性，保證EGFR基因突變檢測結果判讀的客觀性和準確性[8-9]，同時又為實驗室塑造一個良好的工作環境，確保實驗操作每一個過程有效合理[10]。分析A、B兩組同一份石蠟切片檢測相同靶點時有效擴增曲線CT值，以及內質控(內參)CT值之差均小于0.99，最終判定兩組陽性、陰性結果均相符，確定采用二甲苯和松節油兩種脫蠟劑后實時熒光定量PCR擴增實驗結果判讀一致，完全相符。本報道旨在研究石蠟塊EGFR基因突變檢測時使用不同的脫蠟劑后，實時熒光定量PCR擴增曲線形態的相似性，CT值結果比對的差異性，以及最終對實時熒光定量PCR擴增結果相符度的比較。至于在基因突變檢測諸多方法中，如熒光原位雜交技術(FISH)和DNA測序，不同的脫蠟劑對結果有無影響則需要進一步的研究。

綜上所述，采用二甲苯和松節油對石蠟切片行脫蠟處理后，其實時熒光定量PCR分析結果判讀無差異。對于靶點的檢測無影響[11-12]。由于二甲苯具有極強的揮發性，對人體健康有一定的影響，而松節油對人體無害，采用松節油脫蠟既保證了分子實驗室的空氣環境，保護了工作人員的身體，同時又不影響實時熒光定量PCR結果分析的準確性及可靠性[13]，可使實驗室的操作更加規范、科學、合理。

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