長鏈非編碼RNA SNHG6在結腸癌中的表達及其生物學意義

黎豐華，古國財，莊雄標，吳印愛，劉獻棠，王志偉

(廣州軍區廣州總醫院157分院普通外科，廣州 510515)

結腸癌是人類主要惡性腫瘤之一，其發病率和病死率分別位于第3位和第4位。每年約有120萬新確診的結腸癌患者，并且有超過60萬例患者死于結腸癌[1]。腫瘤轉移與腫瘤患者的預后直接相關，當結腸癌確診時，已經有20%～40%患者發生遠處轉移，目前結腸癌外科手術治療的5年生存率在50%左右[2-3]。因此，分析結腸癌的生物學特性，探索其復發轉移機制是臨床研究關注的問題。核仁小分子RNA宿主基因(SNHG)是一類對惡性腫瘤具有重要生物學調控作用的長鏈非編碼RNA(lncRNAs)[4-7]。既往研究報道SNHG6在肝細胞癌中表達明顯上調，并提示腫瘤患者的高復發可能性[8]。然而，目前尚缺少SNHG6對結腸癌生物學作用影響的報道，本文將探究SNHG6在結腸癌組織中的表達特點，及其對結腸癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1細胞與組織來源 試驗所用結腸癌組織和相應癌旁組織(距癌灶邊緣至少2 cm)均為離體30 min內轉移至-80 ℃冰箱保存的新鮮標本，取自2014年1月至2015年10月在本院行根治性手術治療的25例結腸癌患者，所有患者術后均經病理學檢查確診，術前未行放化療等抗腫瘤治療。LoVo結腸癌細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2儀器與試劑 RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)，熒光定量PCR引物序列(上海生工公司)，DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國HyClone公司)，Lipofectamine 2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)，SNHG6-siRNA干擾序列(廣州銳博公司)，CCK-8(cell counting kit 8)細胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天公司)，Matrigel基質膠和Transwell培養板(美國Conirng公司)，上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snail和β-actin兔抗人多克隆抗體(美國Abclonal公司)。CO2培養箱(美國Thermo Fisher公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，實時熒光定量PCR檢測系統(美國ABI公司)，蛋白質印跡法(Western blot)檢測系統(美國Bio-rad公司)。

1.3方法

1.3.1LoVo細胞培養、轉染和分組 LoVo細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養。為探討敲低SNHG6表達對LoVo細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，取對數生長期細胞按照Lipofectamine 2000說明書進行細胞轉染處理，分為4組：空白組(Blank組，不加任何處理)，陰性對照組(NC組；5 μL Lipofectamine 2000+50 pmol NC-siRNA)，第1干擾組(siRNA-1組，5 μL Lipofectamine 2000+50 pmol SHNG6-siRNA-1)及第2干擾組(siRNA-2組，5 μL Lipofectamine 2000+50 pmol SHNG6-siRNA-2)。4組分別處理48或72 h后進行下一步實驗。

1.3.2結腸癌組織和LoVo細胞SNHG6及細胞上皮-間質轉化(EMT)標志物mRNA表達水平的檢測 Trizol法提取組織或者細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板按照SYBR Green Ⅰ法進行目的基因的熒光定量PCR反應。SNHG6引物：上游5′-ATA CTT CTG CTT CGT TAC CT-3′，下游5′-CTC ATT TTC ATC ATT TGC T-3′；EMT標志物能夠反映細胞的EMT進程，主要包括上皮細胞標志物E-cadherin、間質細胞標志物N-cadherin和Vimentin，以及抑制上皮細胞特性的轉錄因子Snail。各目的基因引物序列見表1，采用2-ΔΔCT法表示目的基因的相對表達水平，以β-actin作為內參。

表1 EMT標志物的引物序列

1.3.3LoVo細胞增殖能力的檢測 采用CCK-8法，收集處理24 h后的細胞接種于96孔板，接種密度為1 000個/孔，培養體系為100 μL，繼續常規培養，分別取0、24、48、72 h等培養時間點，加入10 μL CCK-8試劑，培養箱孵育2 h后，450 nm波長下測定光密度值(OD值)，繪制細胞生長曲線。

1.3.4LoVo細胞遷移和侵襲能力的檢測 采用Tranwell法檢測，收集處理48 h后的細胞，將不含胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞接種于Transwell培養板上室，接種密度為5×104個/孔，培養體系為200 μL，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養基，常規培養24 h后取出上室，以4%多聚甲醛固定細胞20 min，0.5%結晶紫染色25 min，以棉簽擦去上室內側細胞，充分洗滌，干燥后倒置顯微鏡下隨機選擇5個高倍視野進行觀察，統計穿膜細胞數。遷移實驗和侵襲實驗方法基本一樣，后者所使用小室經10% Matrigel基質膠包被處理。

1.3.5LoVo細胞EMT標志物表達水平的檢測 采用Western blot檢測，收集處理72 h后的細胞，提取細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，取30 μg樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、Snail(1∶1 000)及β-actin(1∶2 000)等一抗4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，辣根過氧化物酶(HRP)標記兔二抗(1∶15 000)室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，電化學發光法(ECL)顯色并采集圖像。

2 結 果

2.1結腸癌組織和癌旁組織中SNHG6 mRNA表達水平比較 熒光定量PCR結果顯示，結腸癌組織SNHG6 mRNA相對表達水平2.37(0.93，3.66)高于癌旁組織1.5(1.00，2.00)，差異有統計學意義(U=138.0，P=0.000 7)，見圖1。

注：**P<0.01，與癌旁組織比較

圖1結腸癌組織和癌旁組織SNHG6水平比較

2.2SNHG6-siRNA對LoVo細胞SNHG6 mRNA表達水平的影響 LoVo細胞轉染siRNA后，Blank組SNHG6 mRNA相對表達水平為(0.94±0.05)，NC組為(1.03±0.07)，siRNA-1組為(0.24±0.07)，siRNA-2組為(0.34±0.14)，組間比較差異有統計學意義(F=63.04，P=0.000)；進一步兩兩比較，siRNA-1組、siRNA-2組SNHG6 mRNA相對表達水平較Blank組明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)，SNHG6低表達細胞模型構建成功，滿足下一步功能實驗需要，見圖2。

注：**P<0.05，與Blank組比較

圖2 4組LoVo細胞SNHG6相對表達水平比較

2.3敲低SNHG6表達對LoVo細胞增殖能力的影響 LoVo細胞轉染siRNA 后，4組細胞培養24、48、72 h后的增殖活性比較，差異有統計學意義(F=18.6、160.3、32.7，P=0.000)，見表2；進一步兩兩比較，siRNA-1組、siRNA-2組細胞的增殖活性較Blank組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 4組細胞的增殖活性比較±s)

注：**P<0.05，與Blank組比較

2.4敲低SNHG6表達對LoVo細胞的遷移和侵襲能力的影響 LoVo細胞轉染siRNA 后，Transwell遷移實驗顯示，Blank組穿膜細胞數為(148.6±10.9)個，NC組為(150.2±11.9)個，siRNA-1組為(53.0±14.1)個，siRNA-2組為(35.4±20.5)個，組間比較差異有統計學意義(F=85.38，P=0.000)；進一步兩兩比較，siRNA-1組、siRNA-2組細胞發生遷移的數量較Blank組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。Tranwell侵襲實驗顯示，Blank組穿膜細胞數為(126.8±6.9)個，NC組為(139.6±4.2)個，siRNA-1組為(40.2±7.5)個，siRNA-2組為(42.8±8.6)個，組間比較差異有統計學意義(F=289.8，P=0.000)；進一步兩兩比較，siRNA-1組、siRNA-2組細胞發生侵襲的數量較Blank組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.5敲低SNHG6表達對LoVo細胞EMT進程的影響 LoVo細胞轉染siRNA后，熒光定量PCR結果顯示，4組細胞EMT標志物mRNA相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；進一步兩兩比較，siRNA-1組、siRNA-2組E-cadherin相對表達水平高于Blank組，N-cadherin、Vimentin、Snail表達水平低于Blank組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。 Western blot結果顯示，LoVo細胞轉染siRNA后，siRNA-1組、siRNA-2組E-cadherin蛋白表達上調，N-Cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達下調，見圖4。

A：4組細胞遷移和侵襲情況(結晶紫染色，×200)；B：4組細胞的遷移和侵襲數量比較；*：P<0.05，與Blank組比較

圖3 4組LoVo細胞的遷移和侵襲細胞數比較

注：**:P<0.05,與Blank組比較

圖4 4組LoVo細胞EMT標志物蛋白表達水平比較

3 討 論

非編碼RNAs(ncRNAs)是不具有蛋白質編碼功能的RNAs，其中長度超過200個核苷酸的ncRNAs稱為lncRNAs。通過高通量測序和組織芯片技術，研究者發現了成千上萬的lncRNAs。越來越多的研究表明，lncRNAs參與了各種生理或病理過程的調節，其異常表達與多種人類疾病有關，如癌癥[9]、阿爾茨海默癥[10]及心臟病[11]。目前只發現少數lncRNAs與人類癌癥的發生、發展有關，lncRNAs在癌癥中的生物學功能尚不明確[12-13]。近期研究顯示，SNHGs在惡性腫瘤的病理過程中存在差異表達。ZHAO等[7]發現SNHG5具有抑制胃癌發生的作用，其在胃癌組織的表達水平較癌旁組織下調；而陳寶珍等[14]報道，SNHG8在胃癌發生、發展中可能扮演原癌基因角色。本研究發現，SNHG6 mRNA高表達于結腸癌組織，與既往對肝細胞癌的研究報道一致[15]。該研究也指出，SNHG6可參與調節肝癌細胞的增殖和凋亡等過程；進一步研究發現，SNHG6通過與ZEB1、miR-101-3p等分子相互作用，調節肝癌細胞周期、凋亡等多種通路，從而引起腫瘤細胞的增殖、遷移等多種生物行為的改變[15]。本研究也發現，下調SNHG6的表達能夠明顯抑制結腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力，提示SNHG6通過調控結腸癌的增殖和遷移影響腫瘤的發生、發展。

EMT是指上皮細胞失去其上皮特性，而向間質細胞轉化的過程，該轉變有助于腫瘤獲得更強的遷移和侵襲能力，是腫瘤發生轉移和復發的關鍵環節[16-17]。細胞發生EMT時，往往表現為E-cadherin等上皮表型表達下調，而N-cadherin、Vimentin等間質表型表達上調[18]，該過程可以受許多因素調控，其中EMT相關轉錄因子Snail可以通過抑制E-cadherin的表達而促進EMT[19]。本研究發現，下調SNHG6表達后，LoVo細胞內E-cadherin表達上調，而N-cadherin、Vimentin及Snail均表達下調，說明敲低SNHG6的表達可以抑制結腸癌細胞的EMT過程，該抑制作用可能導致細胞遷移和侵襲等惡性生物學特性下降。

綜上所述，本研究發現SNHG6在結腸癌中高表達，并可能通過調節結腸癌的增殖、遷移及侵襲能力而發揮促癌作用；SNHG6參與調節腫瘤的EMT過程，這是其促進結腸癌增殖和轉移的可能機制之一。但本研究也存在諸多不足，如研究樣本量還不夠大、缺少FISH實驗證實SNHG6基因的高表達、細胞實驗深度不夠等；SNHG6通過何種機制調控結腸癌進展，也需要繼續深入研究。

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