微血管內皮細胞對小鼠造血干細胞增殖的影響

錢 怡，楊 敏，林凡莉，汪姝玥，李曉明，黃純蘭

(西南醫科大學附屬醫院血液內科，四川瀘州 646000)

造血干細胞(hemopoietic stem cells，HSCs)存在于造血組織，具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，是所有成熟血細胞的前體細胞。造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是治療惡性血液病、遺傳性疾病及免疫缺陷病的重要手段之一。骨髓微環境對于HSCs的增殖、分化、遷移及歸巢等具有重要的調控作用[1]。HSCT并非僅僅是單純的HSCs輸注，還包括骨髓基質細胞和其他造血調節因子的同時輸注，以便更好、更快地重塑造血系統和免疫系統。然而，人骨髓中HSCs比例較低，極大地限制了HSCT的發展和臨床應用。本文通過研究微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells，MECs)對HSCs增殖的影響，建立一種促進HSCs增殖的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 體質量20～25 g，4～6周齡，雄性或雌性，無特殊病原體(SPF)級C57BL/6小鼠(購自成都達碩生物科技有限公司)和C57系GFP小鼠(購自重慶騰鑫生物公司)。

1.1.2主要儀器與試劑 CO2培養箱(Thermo Forma公司)，超凈工作臺(Air Tech公司)，臺式離心機(Bioridge公司)，倒置熒光顯微鏡及照相系統(Olympus公司)，流式細胞儀(BD公司)，質譜(MS)分離柱、mini MACS磁珠分選裝置、CD117細胞分選試劑盒、小鼠白細胞介素(IL)-3、小鼠干細胞因子(SCF)、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗鼠CD31(CD31-FITC)及藻藍蛋白(APC)標記的CD117(CD117-APC)購自Miltenyi Biotec公司，血管內皮生長因子(VEGF)購自ACRO公司，Ⅰ型膠原酶、明膠粉購自Sigma公司，藻紅蛋白標記的兔抗鼠CD34(CD34-PE)及多甲藻黃素葉綠素蛋白(PerCP)標記的CD45(CD45-PerCP)購自BD公司，羊抗八因子相關抗原(vWF)多克隆抗體、FITC標記的驢抗羊IgG(IgG-FITC)購自Abcam公司，Ficoll分離液購自TBD公司，DMEM-F12購自南京三生生物公司。

1.2方法

1.2.1MECs分離、培養及鑒定

1.2.1.1MECs的培養 MECs使用添加有20%胎牛血清(FBS)、2 ng/mL VEGF、100 U/mL肝素、0.1 mg/mL青霉素及鏈霉素的DMEM-F12完全培養基進行培養。

1.2.1.2MECs的分離與培養 頸髓離斷處死小鼠，75%乙醇浸泡約5 min。逐層剪開胸腔，剝離肺組織外的臟層胸膜，剪取肺葉組織，除掉可見的支氣管和大血管。剪碎肺組織至1 mm左右，裝入離心管。加入與組織等量的含2%牛血清蛋白(BSA)和0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液，吹打混勻，37 ℃搖床消化。每5分鐘吹打1次，共消化約30 min。加入FBS和DMEM-F12終止消化，過200目濾網。300×g離心10 min，棄上清液。加入DMEM-F12重懸，400×g離心10 min，棄上清液，用DMEM-F12完全培養基重懸。經細胞計數及活力測定。以1×106個/cm2密度接種于0.1%明膠包被的24孔板，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度培養箱培養。培養24 h后進行首次全量換液，此后每2～3天換1次，逐日顯微鏡下觀察。0.25%胰蛋白酶消化“鋪路石”樣貼壁細胞用于流式細胞儀(FCM)鑒定和共培養。

1.2.1.3免疫熒光鑒定 第8天24孔板中的細胞2孔，設對照孔、實驗孔，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加4%多聚甲醛200 μL，室溫固定15 min。去掉多聚甲醛，PBS洗滌2次，加入5% BSA封閉30 min。實驗孔加5 μL CD31-FITC和45 μL PBS，對照孔加50 μL PBS，4 ℃冰箱避光孵育10 min。PBS洗滌后加100 μL 0.2% Triton X-100溶液，混勻，5 min后PBS洗滌。加入5 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和100 μL PBS，混勻，避光孵育3 min，PBS洗滌。熒光顯微鏡下觀察采圖，隨機選取3個視野(×200)，計算陽性細胞百分率。

1.2.1.4流式鑒定 設對照管、實驗管1、實驗管2、實驗管3，均加上述制備的細胞懸液200 μL(細胞數大于1×105個)。對照管加IgG-FITC、IgG-PE、IgG-PerCP各5 μL，實驗管1加5 μL CD31-FITC，實驗管2加5 μL CD34-PE，實驗管3加5 μL CD45-PerCP，混勻，4 ℃避光孵育15 min。PBS洗滌，200×g離心5 min，去上清液。400 μL PBS重懸上機檢測。

1.2.1.5vWF-FITC 流式鑒定 設置對照管、實驗管，均加備用細胞懸液200 μL。離心后加200 μL 0.4%多聚甲醛重懸，室溫下固定20 min，PBS洗滌離心后加200 μL 0.2%皂素溶液重懸，靜置20 min，PBS洗滌離心。200 μL PBS混勻細胞。實驗管加4 μL羊抗vWF多克隆抗體，對照管加4 μL羊IgG，室溫孵育30 min。PBS洗滌離心后200 μL PBS重懸，加4 μL驢抗羊IgG-FITC，室溫避光孵育20 min。洗滌，400 μL PBS重懸上機檢測。

1.2.2GFP小鼠骨髓HSCs的分離、鑒定

1.2.2.1密度梯度離心與磁珠分選 頸椎脫臼法處死小鼠，置于75%乙醇中浸泡約5 min。逆向解剖法剝離股骨、脛骨，PBS沖洗。剪去骨端約2 mm，暴露髓腔。1 mL注射器插入骨髓腔，用PBS反復沖洗髓腔至發白，沖出的骨髓收集于離心管，過200目濾網。離心去上清液，加1 mL PBS重懸，混勻。加2 mL復溫的Ficoll分離液(1.084 g/mL)于離心管，加樣槍沿管壁緩慢加入上述細胞懸液。20 ℃ 400×g離心30 min。收集中間云霧層(即單個核細胞層)，以1∶3比例加入PBS稀釋，制成細胞懸液，400×g離心10 min，棄上清液，重復1次。經活力測定及計數。加入預冷Buffer[0.5% BSA、2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、PBS]3 mL，吹打混勻，22 ℃ 300×g離心10 min，棄上清液。按照每1×108個MNCs用80 μL預冷Buffer重懸，每1×107個MNCs加20 μL CD117微珠標記細胞，混勻，4 ℃冰箱避光孵育15 min。每1×107個MNCs用1 mL Buffer洗滌，300×g離心10 min，去上清液，每1×108個MNCs加入500 μL Buffer重懸。連接MACS分選裝置，500 μL Buffer潤濕MS柱，骨髓細胞懸液滴入MS柱，收集洗脫細胞。Buffer沖洗MS柱3次，每次500 μL。MS柱移出磁場，加1 mL Buffer，配備活塞加壓快速推出滯留在MS柱內的標記細胞，離心管收集。對CD117+細胞進行活力測定并計數，留作流式純度鑒定和共培養使用。

1.2.2.2FCM檢測CD117+細胞純度及CD117 CD34表達率 設置對照管、實驗管1和2。對照管加MNCs懸液200 μL、IgG-APC和IgG-PE各5 μL，實驗管1和2均加分選后的陽性細胞懸液200 μL和5 μL CD117-APC，實驗管2再加CD34-PE 5 μL，混勻，4 ℃冰箱避光孵育30 min，PBS洗滌離心，加400 μL PBS重懸上機檢測。

1.2.3MECs促進HSCs增殖

1.2.3.1HSCs培養基 添加有20% FBS、25 ng/mL SCF、25 ng/mL IL-3、0.1 mg/mL青霉素及鏈霉素的DMEM-F12完全培養基。

1.2.3.2分組 (1)對照組：HSCs單培養；(2)共培養組：HSCs+MECs。

1.2.3.3細胞準備 (1)MECs：“鋪路石”的MECs經胰酶消化后，收集入離心管，PBS洗滌離心。MECs培養基重懸，密度為5.0×104個/mL。(2)HSCs：MACS收獲的HSCs，PBS洗滌離心。HSCs培養基重懸，密度為5.0×104個/mL。

1.2.3.4種板與換液 (1)共培養組：MECs接種于24孔板，每孔200 μL，設3個復孔。37 ℃、5% CO2、95%濕度孵箱培養，細胞貼壁后去掉培養基每個復孔均加HSCs懸液200 μL、HSCs培養基300 μL，繼續培養。(2)對照組：24孔板，每孔HSCs懸液200 μL、HSCs培養基300 μL，設3個復孔。37 ℃、5% CO2、95%濕度孵箱中培養。每3天半量換液，培養7 d。

1.2.3.5熒光顯微鏡觀察 熒光顯微鏡下觀察生長情況，每天取3個復孔懸浮細胞計數，計算擴增倍數。

1.2.3.6FCM檢測共培養組擴增后CD117 CD34表達率 收集MECs組3個復孔HSCs，PBS洗滌離心，400 μL PBS重懸，一式兩份，1份加IgG-APC、IgG-PE各5 μL，混勻，作同型對照；另1份加CD117-APC、CD34-PE各5 μL，混勻。4 ℃冰箱避光孵育30 min，PBS洗滌離心，400 μL PBS重懸上機檢測。

2 結 果

2.1MECs分離、培養、鑒定

2.1.1MECs原代培養 接種后6 h見貼壁細胞，第3天細胞聚集生長，形成形態大小較一致的細胞簇，第6天相鄰細胞突起彼此相連，成“血管樣”改變，第14天達80%融合，呈“鋪路石”外觀，見圖1。

2.1.2CD31免疫熒光鑒定 熒光顯微鏡下，細胞呈綠色，細胞核呈藍色，見圖2；培養第8天陽性細胞百分率為54.5%。

2.1.3MECs流式鑒定 vWF、CD31、CD34、CD45的陽性率分別為81.39%、45.80%、57.48%、0.17%，見圖3。

2.2GFP小鼠骨髓HSCs分離、鑒定

2.2.1骨髓HSCs分離 骨髓經密度梯度離心后分4層，中間的云霧層即為MNCs。平均每只小鼠骨髓可獲得約1.1×108個MNCs，活細胞率為98%。

2.2.2CD117+細胞回收及純度 每只小鼠MNCs經MACS分選后可獲約4.7×105個CD117+細胞，活細胞率為97%，純度為99.51%，見圖4。

圖1 MECs原代培養(×40)

A：DAPI染色圖；B：CD31抗體染色圖；C：A、B合成圖

圖2 CD31抗體免疫熒光鑒定(×200)

圖3 流式檢測MECs 的vWF、CD31、CD34、CD45表達

圖4 MACS分選后的CD117+細胞純度分析

2.3MECs促HSCs增殖

2.3.1對照組和共培養組細胞擴增變化 共培養第0天，兩組HSCs計數均為1.00×104個；共培養第7天，對照組、共培養組HSCs計數分別為6.92×104、12.31×104個，見表1。熒光顯微鏡下觀察HSCs生長情況：共培養第2、4、6、7天，共培養組綠色熒光細胞多于對照組，見圖5。第1～7天，共培養組與對照組細胞計數的相對變化倍數分別為1.21、1.35、1.50、1.72、1.71、1.75和1.78，兩組細胞計數比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1；第4天變化最明顯，見圖6。對照組第1～7天較第0天的HSCs細胞計數比較：第1天擴增0.99倍(P>0.05)，第2～7天擴增倍數分別為1.42、2.30、4.25、5.66、6.45、6.92(P<0.05)。共培養組第1～7天較第0天的HSCs細胞計數比較：第1～7天擴增倍數分別為1.20、1.92、3.45、7.31、9.72、11.28、12.31(P<0.05)。

2.3.2共培養組共培養前后HSCs CD117 CD34共表達率變化 共培養前HSCs CD117 CD34共表達率為75.85%，見圖7。共培養后HSCs CD117 CD34共表達率為92.06%，見圖8。共培養7天后，共培養組HSCs CD117 CD34共表達率增加。

圖5 熒光顯微鏡下觀察HSCs生長情況(×100)

圖6 共培養組與對照組HSCs細胞計數的相對變化

圖7 共培養前HSCs D117 CD34共表達率流式檢測

組別第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天對照組 1.000.99±0.03 1.42±0.022.30±0.064.25±0.205.66±0.126.45±0.14 6.92±0.17共培養組 1.00 1.20±0.04* 1.92±0.45*3.45±0.09*7.31±0.06*9.72±0.12*11.28±0.12*12.31±0.11*

注：**P<0.05，與對照組比較

圖8 共培養后HSCs CD117 CD34共表達率流式檢測

3 討 論

骨髓龕按照骨髓解剖部位和功能作用差異分為兩類：以成骨細胞為主的成骨龕，以內皮細胞(endothelial cells，ECs)為主的血管龕[2]。前者維持HSCs的穩態，后者調控HSC增殖、分化、動員及歸巢[3]。然而不同組織來源的ECs生物學特性存在差異。MECs存在于毛細血管、微靜脈及微動脈，肺組織含量最多[4]，取材簡便，因此作為本實驗ECs來源。目前ECs鑒定方法主要有3種：細胞形態、細胞抗原標記、細胞器超微結構。W-P小體是代表性的ECs細胞器超微結構，但是該小體會因種屬、部位、培養條件、細胞狀態的差異而呈現不同的形狀和結構，出現概率極低[5-7]。故本實驗選用前兩種方法鑒定ECs。CD31、CD34、vWF是ECs鑒定較為理想的抗原標記。本實驗小鼠肺組織經Ⅰ型膠原酶消化的細胞在培養第6天細胞突起彼此相連，成血管樣改變，第14天長至80%融合，呈“鋪路石”樣。培養第8天的細胞CD31熒光檢測陽性率為54.5%。第14天細胞流式檢測vWF、CD31、CD34、CD45的陽性率分別為81.39%、45.80%、57.48%、0.17%，符合文獻報道[8]。故本實驗成功培養出肺MECs。

HSCs主要存在于骨髓龕，目前骨髓分離HSCs的方法主要有免疫磁珠分選和流式細胞分選。免疫磁珠分選法操作簡便、快速，MACs分離純度高達99%，細胞損傷小，可直接用于培養研究和流式檢測。CD117即SCF受體，主要表達于造血干/祖細胞。本實驗選用CD117作為分選小鼠HSCs免疫標記。每只小鼠骨髓經CD117磁珠分選后可收獲4.7×105個陽性細胞，純度為99.51%，成功分選出骨髓HSCs。

共同起源學說認為血管ECs與早期HSCs都是由胚胎卵黃囊血島細胞分化而來[9]。激活小鼠ECs中的蛋白激酶B1(AKT1)，不僅可以擴增HSCs，還能重建輻射小鼠的造血系統[10]。腦MECs通過胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP-3)功能性克隆促進CD34+CD38-HSCs體外增殖[11]。MECs能促進損傷后HSCs的保持和更新[12]。ECs作為臍血細胞的滋養層，可明顯增加擴增CD34+CD38-細胞數量[13]。綜上研究，ECs會調控HSC增殖、分化、歸巢。本研究發現共培養過程中：(1)培養時間增加，兩組HSCs數量均增加，MECs組較對照組增加更明顯。(2)第1～7天均與第0天對比，共培養組及對照組HSCs均擴增，且共培養組擴增倍數大于對照組，第4天MECs促進HSCs增殖的作用最明顯。由此可見，MECs促進HSCs增殖，且第4天最明顯。

綜上所述，共培養第7天的共培養組懸浮細胞HSCs CD117 CD34共表達率增加，而既往研究發現小鼠年齡和狀態會影響HSCs CD34抗原表達。5周齡以下的小鼠，包括胚胎期、新生小鼠，所有的HSCs都表達CD34，7周齡小鼠有CD34-的HSCs，10～20周齡大多數HSCs不表達CD34[14]。小鼠CD34+HSCs與CD34-HSCs可以相互轉化，活化狀態下的HSCs表達CD34[15]，人HSCs CD34抗原表達是可逆的[16]。4～6周齡小鼠HSCs分為CD34+和CD34-群[17]。筆者認為MECs可以促進HSCs CD34表達，但其具體機制需要進一步研究。

[1]MENDELSON A，FRENETTE P S.Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration[J]．Nat Med，2014，20(8)：833-846．

[2]ZHAO M， LI L．Regulation of hematopoietic stem cells in the niche[J]．Sci China Life Sci，2015，58(12)：1209-1215．

[3]MERCIER F E，RAGU C，SCADDEN D T．The bone marrow at the crossroads of blood and immunity[J]．Nat Rev Immunol，2011，12(1)：49-60．

[4]WINIARSKI B K，ACHESON N，GUTOWSKI N J，et al．An improved and reliable method for isolation of microvascular endothelial cells from human omentum[J]．Microcirculation，2011，18(8)：635-645．

[5]BLEAU C，FILLIOL A，SAMSON M，et al．Brain invasion by mouse hepatitis virus depends on impairment of tight junctions and beta interferon production in brain microvascular endothelial cells[J]．J Virol，2015，89(19)：9896-9908．

[6]METCALF D J，NIGHTINGALE T D，ZENNER H L，et al．Formation and function of Weibel-Palade bodies[J]．J Cell Sci，2008，121(Pt 1)：19-27．

[7]LIU Y，XUE Q，TANG Q，et al．A simple method for isolating and culturing the rat brain microvascular endothelial cells[J]．Microvasc Res，2013，90：199-205．

[8]WANG J D，KHAFAGY E S，KHANAFER K，et al．Organization of endothelial cells,pericytes,and astrocytes into a 3d microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier[J]．Mol Pharm，2016，13(3)：895-906．

[9]ROBERTSON S，KENNEDY M，KEL-

LER G．Hematopoietic commitment during embryogenesis[J]．Ann N Y Acad Sci，1999，872：9-16．

[10]KOBAYASHI H，BUTLER J M，O′DONNELL R，et al．Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells[J]．Nat Cell Biol，2010，12(11)：1046-1056．

[11]LIU L Q，SPOSATO M，LIU H Y，et al．Functional cloning of IGFBP-3 from human microvascular endothelial cells reveals its novel role in promoting proliferation of primitive CD34+CD38-hematopoietic cells in vitro[J]．Oncol Res，2003，13(6/10)：359-371．

[12]NOLAN D J，GINSBERG M，ISRAELY E，et al．Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration[J]．Dev Cell，2013，26(2)：204-219．

[13]ROSLER E，BRANDT J，CHUTE J，et al．Cocultivation of umbilical cord blood cells with endothelial cells leads to extensive amplification of competent CD34+CD38-cells[J]．Exp Hematol，2000，28(7)：841-852．

[14]OGAWA M，TAJIMA F，ITO T，et al．CD34 expression by murine hematopoietic stem cells.Developmental changes and kinetic alterations[J]．Ann N Y Acad Sci，2001，938：139-145．

[15]SATO T，LAVER J H，OGAWA M．Reversible expression of CD34 by murine hematopoietic stem cells[J]．Blood，1999，94(8)：2548-2554．

[16]DAO M A，AREVALO J，NOLTA J A．Reversibility of CD34 expression on human hematopoietic stem cells that retain the capacity for secondary reconstitution[J]．Blood，2003，101(1)：112-118．

[17]MOREL F，GALY A，CHEN B，et al．Equal distribution of competitive long-term repopulating stem cells in the CD34+and CD34-fractions of Thy-1lowLin-/lowSca-1+bone marrow cells[J]．Exp Hematol，1998，26(5)：440-448．