兒童過敏性哮喘患者中Th17/Treg比值與IDO相關性的研究*

胡 影，陳志強，金 玲，王 梅，廖 偉

(陸軍軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院兒科，重慶 400038)

過敏性哮喘(哮喘)是一種以氣道高反應性為特征的變態(tài)反應性炎癥性疾病，近年來發(fā)現(xiàn)Th17細胞及調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)在哮喘發(fā)病中占有重要地位。吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3 dioxygenase，IDO)是一種色氨酸分解代謝的限速酶，在外周免疫耐受中有重要作用，近年發(fā)現(xiàn)在過敏性疾病中有重要的作用[1-2]。有研究顯示氣道內(nèi)類漿細胞樣DC(plasmacytoid DC，pDC)可誘導CD4+T細胞分化成Treg誘導免疫耐受[3]，有趣的是Treg致耐受性是通過其表達IDO來抑制T細胞分化實現(xiàn)的[4]。因此筆者推測在兒童過敏性哮喘患者中Th17/Treg失衡與IDO具有關聯(lián)性。而目前IDO、Th17/Treg失衡與兒童過敏性哮喘關系的臨床研究尚未見報道，本研究探討兒童過敏性哮喘患者中IDO水平與Th17/Treg失衡的關聯(lián)性及其可能的分子機制。

1 資料與方法

表1 觀察組與對照組臨床及實驗室特征

1.1一般資料 從本院兒科門診患兒中產(chǎn)生，總計入組5歲以上過敏性哮喘患兒(根據(jù)病情嚴重程度進行回顧性分級)33例(該例數(shù)為通過預期差異顯著性推算出，觀察組)，并收入33例同期體檢的年齡、性別匹配的健康兒童作為對照組。選取患兒及對照組時已考慮患者年齡、性別等的代表性和普遍性，減少偏移，分布盡量呈正態(tài)，兩組臨床資料具有可比性。該實驗已在中國臨床試驗注冊中心注冊通過，注冊號為ChiCTR-COC-15006080；并在本醫(yī)院倫理委員會會議審查通過；所有入組對象均在患兒家屬處簽署知情同意書。觀察組患者納入標準：(1)年齡5～12歲；(2)初次診斷和既往雖然被診斷但尚未按哮喘規(guī)范治療；(3)2周內(nèi)未接受吸入性糖皮質激素、白三烯受體拮抗劑等治療。哮喘診斷標準：(1)反復發(fā)作喘息、咳嗽、氣促、胸悶，多與接觸變應原、冷空氣、物理或化學性刺激、呼吸道感染及運動等有關，常在夜間和(或)清晨發(fā)作或加劇；(2)發(fā)作時在雙肺可聞及散在或彌漫性，以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長；(3)上述癥狀和體征經(jīng)抗哮喘治療有效或自行緩解；(4)除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、氣促和胸悶；(5)臨床表現(xiàn)不典型者(如無明顯喘息或哮鳴音)，應至少具備以下1項：①支氣管激發(fā)試驗或運動激發(fā)試驗陽性；②證實存在可逆性氣流受限，即支氣管舒張試驗陽性：吸入速效β2受體激動劑硫酸沙丁胺醇后15 min第一秒用力呼氣量(FEV1)增加大于12%；③最大呼氣流量(PEF)每日變異率(連續(xù)監(jiān)測1～2周)20%。符合第1～4條或第4，5條者，可以診斷為哮喘。對照組入選標準：同期募集兒科門診體檢的健康兒童33例(未罹患哮喘，近期無感染性疾病、免疫性疾病、無心肺疾病，近2周未使用糖皮質激素及免疫調(diào)節(jié)劑)，年齡和性別等均有較好的分布和代表性。排除標準：(1)近2周內(nèi)口服或靜脈使用過糖皮質激素或免疫調(diào)節(jié)劑；(2)合并其他免疫性疾病如結核病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、幼年性特發(fā)性關節(jié)炎等；(3)發(fā)病4周內(nèi)曾患感染性疾病，如上呼吸道感染、肺炎等；(4)心肺功能衰竭者。

1.2方法 對受試對象進行完整的病史采集、體格檢查、肺功能檢查、皮膚點刺過敏原檢測、嗜酸性粒細胞計數(shù)(EC)；外周靜脈血檢測，確定納入為試驗對象后立即對觀察組及對照組兒童進行血液采集1次，處理步驟如下，(1)標本采集：采集受試者靜脈血4 mL(肝素抗凝)。全血離心后收集血漿于-80 ℃凍存。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)；(2)指標檢測：流式細胞術(FACS)檢測Th17細胞[CD4+RORγt+白細胞介素(IL)-17+T細胞]及調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+T細胞)；聚合酶鏈反應(ELISA)檢測血漿及PBMC中的IL-10、IL-17、IL-6、轉化生長因子-β(TGF-β)細胞因子水平；高效色譜液相法(HPLC)檢測色氨酸及犬尿氨酸濃度。用犬尿氨酸濃度 (μmol/L)/ 色氨酸濃度(μmol/L)來反映IDO活性水平。誘導痰檢測：確定納入為試驗對象后立即對觀察組及對照組兒童進行誘導痰液采集1次，3%高滲鹽水(1.5 mL 10% NaCl+2.5 mL 0.9% NaCl)霧化后吸痰；誘導痰上清液保存于-70 ℃，用HPLC檢測色氨酸及犬尿氨酸濃度。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS18．0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，多組比較前先進行正態(tài)分布檢驗(Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk檢驗)和方差齊性檢驗(Levene檢驗)，對于滿足正態(tài)分布和方差齊性的組間計量資料采用獨立樣本t檢驗，實驗結果用均值(95%CI)表示；對于不滿足正態(tài)分布的資料采用非參數(shù)統(tǒng)計分析中的 Mann-WhitneyU檢驗，實驗結果用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q25,Q25)]表示；對于分析多組間的相關性采用多元線性回歸分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1觀察組與對照組臨床及實驗室檢查特征 兩組對象臨床特征見表1，與預期的一致，兩組患兒年齡、性別相匹配，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組比較，觀察組兒童皮膚點刺試驗陽性率顯著升高(P<0.01)，EC顯著升高(P<0.01)；觀察組肺功能指標FEV1.0/FVC%顯著下降(P<0.01)。

2.2過敏性哮喘組及對照組誘導痰及血中IDO活性表達 觀察組誘導痰液中IDO活性水平較對照組顯著降低(P<0.01)，外周血中IDO活性水平較對照組相比亦顯著降低(P<0.01)，見表1、圖1。

A:誘導痰；B:外周血；a:P<0.01,b:P<0.01

圖1觀察組及對照組誘導痰及外周血IDO活性水平

2.3觀察組及對照組外周血中Th17細胞、Treg的表達 采用流式細胞術檢測Th17細胞(CD4+ROR-γt+IL-17+)及Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+)(圖2A、C)。觀察組Th17細胞較對照組明顯升高(圖2B)，P<0.05；而Treg較對照組明顯降低(圖2D)，P<0.05。與對照組對比，觀察組中Th17/Treg比例明顯升高(圖2E)，P<0.05。

A:外周血Th17細胞流式圖像;B:外周血中Th17細胞表達散點圖;C:外周血Treg流式圖像;D:外周血中Treg表達散點圖;E:外周血中Th17/Treg比例分析圖；a:P<0.05,b:P<0.01

圖2流式細胞術檢測對照組及觀察組外周血中Th17細胞、Treg、Th17/Treg比例

2.4外周血中Th17細胞和Treg相關細胞效應因子的表達水平 觀察組外周血PBMC中IL-17、IL-6表達水平較對照組明顯升高(P<0.01、P<0.01)；TGF-β、IL-10表達水平較對照組明顯降低(P<0.01)，見表2。

表2 對照組及哮喘組外周血中Th17和Treg細胞相關細胞效應因子的表達水平

2.5兒童過敏性哮喘患者誘導痰液及外周血中IDO活性與Th17/Treg失衡間相關性分析 在兒童過敏性哮喘患者中，誘導痰液中IDO活性均與外周血Treg細胞濃度呈正相關性，與Th17細胞濃度無明顯相關性，與Th17/Treg比例呈負相關性，見表3、圖3。外周血中IDO活性與Th17、Treg、Th17/Treg之間的關系亦呈現(xiàn)相同規(guī)律，見表4、圖4。

A：IOD與Th17相關性；B:IDO與Treg相關性；C：IDO與Th17/Treg比例相關性

圖3觀察組誘導痰中IDO活性與Th17細胞、Treg、Th17/Treg比例間的相關性

圖4 觀察組外周血中IDO活性與Th17細胞、Treg、Th17/Treg比例間的相關性

IDO(誘導痰)Th17TregTh17/TregPearson 相關性-0.1760.524-0.418P(雙側)0.3520.0030.007

表4 哮喘組外周血中IDO水平與Th17細胞、Treg、Th17/Treg比例間的相關性

3 討 論

Th1/Th2失衡是過敏性哮喘發(fā)病機制中的關鍵環(huán)節(jié)。然而近年來發(fā)現(xiàn)Th17細胞及Treg細胞在哮喘發(fā)病中也占有重要地位。Treg細胞不同于Th1和Th2細胞，它具有免疫抑制功能， Treg細胞的形成在氣道對過敏原的免疫耐受中占有重要地位[5]。氣道Treg細胞誘導的免疫耐受可能與其表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)，分泌IL-10、TGF-β等細胞因子有關[6]。本研究亦發(fā)現(xiàn)在兒童過敏性哮喘患者中Treg表達受抑制，IL-10、TGF-β等細胞因子表達亦明顯減少。Th17細胞是2005年新發(fā)現(xiàn)的CD4+T 細胞亞群，以分泌IL-17為特征，ROR-γt是其重要轉錄因子，IL-17不僅介導中性粒細胞性氣道炎癥，也調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞和巨噬細胞性炎癥等，與哮喘發(fā)病密切相關[7]。Th17細胞和Treg細胞來源于共同的初始T細胞，在不同的細胞因子環(huán)境下分化而成，在分化功能上相互抑制對維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)起重要作用。因此哮喘發(fā)生時CD4+T細胞除了向Th2細胞偏移外，還在某些因子影響下向Th17細胞偏移，而抑制了Treg細胞的生成。本研究證實大于5歲的過敏性哮喘兒童患者中仍然存在Th17/Treg的失衡；且與正常兒童比較，IL-17、IL-6水平顯著升高，TGF-β、IL-10水平顯著降低。

IDO是一種色氨酸分解代謝的限速酶，其在感染、妊娠、自身免疫及瘤樣病變中的免疫調(diào)節(jié)及免疫誘導作用已經(jīng)得到廣泛認可；IDO在嗜酸性粒細胞、內(nèi)皮細胞及肺上皮細胞中也被檢測到，顯示出其在過敏反應中的作用[8-9]。但國內(nèi)外在兒童過敏性哮喘患者氣道誘導痰液中IDO的活性情況尚無相關研究報道。本試驗研究發(fā)現(xiàn)IDO在過敏性哮喘兒童患者外周血及誘導痰液中的表達均較健康兒童顯著降低。提示IDO活性可抑制氣道過敏反應，在兒童過敏性哮喘發(fā)病機制中可能起到保護性作用。

有研究證實IDO活性在過敏癥患者中低于正常健康個體[10]；沒有臨床癥狀的過敏患者血漿IDO活性及IL-10水平均比有癥狀的過敏患者及健康個體高[11]。MANEECHOTESUWAN等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)輕中度持續(xù)成年哮喘患者誘導痰中IDO的低活性可通過吸入糖皮質激素后增強，其可能是通過刺激IL-10的產(chǎn)生來介導的；且辛伐他汀增強糖皮質激素對Th17/Treg失衡的調(diào)節(jié)作用也是通過上調(diào)IDO及IL-10，下調(diào)IL-6、IL-23的表達來實現(xiàn)的。因此本研究推測IDO在Th17/Treg分化失衡機制中可能扮演了非常重要的角色，且可能與IL-6、IL-10等細胞效應因子有關。另外，BETTELLI等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)Th17和iTreg產(chǎn)生于同一前體細胞CD4+Foxp3-T細胞，當加入TGF-β時，此細胞轉化為Foxp3+Treg細胞；但當加人TGF-β和IL-6時，此CD4+Foxp3-的T細胞轉化為Th17細胞[14]，表明IL-6做為關鍵細胞因子決定CD4 Foxp3-T細胞是轉化為Treg還是Th17細胞。有趣的是BABAN等[15]報道在IL-6基因敲出的大鼠靜脈注射IDO誘導劑ISS-ODN后，在脾臟發(fā)現(xiàn)Treg增多，而皮下注射IDO抑制劑1-MT后可使脾臟pDC表達IL-6，從而使Treg向Th17細胞轉化[15]。因此更加證實了IDO在Th17/Treg分化失衡中的作用：即在一定條件下IDO可作為Th17細胞向Treg轉換的分子“開關”。 與這些試驗研究結果一致，本臨床研究顯示正常健康兒童IDO水平及Treg表達均較過敏性哮喘兒童高，且兩者呈顯著的正相關關系，而IDO水平與Th17/Treg比例呈負相關關系，且IL-6水平明顯降低，而IL-10水平顯著升高。因此本研究推測IDO參與了Th17/Treg分化過程，根據(jù)實驗結果結合國外文獻分析，筆者推測IDO可能是通過抑制IL-6表達、促進IL-10產(chǎn)生而使Th17細胞向Treg轉化來發(fā)揮其保護作用的。當然，這仍需進一步體外實驗給予論證。

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