穩定同位素標記1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑的合成

徐仲杰，涂亞輝，鐘佳琪，孫 雯，汪忠華，王浩然，白少飛，吳范宏

(1.上海化工研究院有限公司 國家同位素工程技術研究中心 上海分中心，上海 200062；2.上海化工研究院有限公司 上海穩定性同位素工程技術研究中心，上海 200062；3.上海應用技術大學，上海 201418)

目前，各種癌癥嚴重威脅人類生命，研發高效的抗癌藥物已刻不容緩。早期的抗腫瘤藥物，對腫瘤細胞和正常細胞缺乏選擇性，在殺死腫瘤細胞的同時也殺死正常細胞。近年來，新發現的分子靶向藥物，能夠針對性地作用于腫瘤細胞，療效良好，不良反應少，逐漸成為抗腫瘤藥物的發展方向。1997年，全球第一個靶向抗腫瘤藥物——利托普希單抗上市，藥物研究已進入精準醫療時代，全球每年都有多個面向不同作用靶點的抗腫瘤藥物進入全球醫藥市場。

20世紀70年代，美國科研人員在非洲灌木矮柳樹的樹皮中分離出天然產物——考布他汀(Combretastatin A4, CA4)。并研制出分子靶向藥物，能夠很好的抑制微管蛋白聚合和分裂[1]。由于其良好的生物活性，英國、美國等已將其引入臨床評估，同時越來越重視對CA4結構的修飾以及類似物的開發，針對CA4結構的修飾主要集中在3個部位：A環、B環和順式雙鍵，成為抗腫瘤新藥研究的熱點方向之一[2-12]。

汪忠華等[13-14]報道了一種以苯胺丙炔和疊氮衍生物反應制備1,2,3-三氮唑衍生物的方法，具有一定的抗腫瘤活性。碳氘鍵比碳氫鍵更穩定，有利于延長藥物在體內的代謝時間，提高藥效，而氟代藥物分子小，相容性高，本課題組利用氘標記合成的優勢，在前期分子活性結構的基礎上，引入氘標記的-OCD3基團，形成氘代和氟代的協同作用，創制新型氘代氟代氨甲基三氮唑類抗腫瘤新藥。

1 主要儀器與試劑

IKA C-MAG HS7加熱磁力攪拌器：德國IKA公司；RE-52A型旋轉蒸發儀：上海衛凱儀器有限公司；BrukerSpectrospin 500 UltrashieldTM核磁共振儀：德國Bruker公司；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜：美國Waters公司；TSQ Quantum Acess液質聯用儀：美國熱電公司。

碘甲烷-D3：豐度99.0%，上海化工研究院有限公司；5-氟-2-硝基苯酚：分析純(AR)，上海阿拉丁試劑有限公司；3-甲氧基苯胺、3-溴丙炔：AR，上海泰坦科技股份有限公司；濃鹽酸、亞硝酸鈉、甲醇、異丁醇、抗壞血酸、硫酸銅：均為AR，中國醫藥集團上海化學試劑公司。

2 實驗方法

化合物的合成采用逆合成分析，結合有機合成原理，以穩定、廉價、易得的碘甲烷-D3為原料，經過甲基化、硝基還原、炔基取代、疊氮化以及環化反應合成1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑。合成路線示于圖1。

2.1 5-氟-2-硝基苯甲醚-D3(2)的合成

圖1 化合物(8)的合成路線Fig.1 The synthetic route of compound (8)

在100 mL三口反應瓶中加入化合物5-氟-2-硝基苯酚3.4 g、無水碳酸鉀5.0 g和無水丙酮40 mL，氮氣置換三次，冰浴攪拌10 min后，用注射器緩慢加入碘甲烷-D33.2 g，繼續冰浴反應0.5 h，然后升溫回流6 h停止反應，水洗，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮，得到黃色固體5-氟-2-硝基苯甲醚-D3(2)，收率90.0%(以碘甲烷-D3計)。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ 6.75(m,2H)，7.95(dd,J1=9.0 Hz,J2=6.0 Hz,1H)，鑒定為目標產物。

2.2 4-氟-2-甲氧基苯胺-D3(3)的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入自制的5-氟-2-硝基苯甲醚-D33.5 g，加入50 mL乙醇溶解，攪拌。稱取2.0 g的五水合硫酸銅溶于30 mL水中，加入至上述體系中，冰水浴下，分批向反應體系中加入硼氫化鈉3.8 g，繼續在冰水浴條件下反應3 h，用氯仿萃取三次，水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓去除溶劑得到棕色液體2.8 g，收率為90.5%(5-氟-2-硝基苯甲醚-D3計)。ESI-MS：145.09(M+1)+，1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ 3.59(br,2H)，6.47～6.61(m,2H)，7.25(s,1H)，鑒定為目標產物。

2.3 4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3(5)的合成

在100 mL三口燒瓶中加入無水碳酸鉀7.0 g和5-氟-2-硝基苯胺2.8 g，加入50 mL丙酮攪拌均勻，在常溫條件下滴加溴丙炔2.0 g，滴加結束后升溫至50 ℃反應4 h，停止反應。水洗后用氯仿萃取，無水硫酸鎂干燥，抽濾，減壓除溶得黑棕色粗品。柱層析提純后得到棕色液體2.9 g，收率85.7%(以4-氟-2-甲氧基苯胺-D3計)。ESI-MS：182.1(M)+，1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ2.21(t,J=2.4 Hz,1H)，3.94(d,J=1.8 Hz,2H)，4.26(br,1H)，6.56～6.62(m,3H)，鑒定為目標產物。

2.4 間甲氧基苯疊氮化鈉(7)的合成

將10 mL水和10 mL鹽酸先后加入100 mL三口燒瓶中，冰水浴冷卻后，加入3-甲氧基苯胺2.5 g，攪拌5 min，加入含亞硝酸鈉1.6 g的水溶液，稱取疊氮化鈉1.6 g溶于水中，緩慢地滴加到反應體系中，加完后繼續攪拌1 h，薄層色譜檢測反應進行直至原料反應完全。萃取，洗滌，干燥，抽濾，負壓除溶劑后得到間甲氧基苯疊氮化鈉3.1 g，收率85.1%(以間甲氧基苯胺計)。

2.5 1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑-D3(8)的合成

在100 mL三口燒瓶中依次加入間甲氧基苯疊氮化鈉1.2 g，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D31.3 g，五水合硫酸銅0.15 g，抗壞血酸鈉1.2 g，異丁醇10 mL，水10 mL，室溫攪拌2 h，停止反應。采用4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3后處理方法得到橘色固體粗品，柱層析得到橘色固體2.9 g，收率86.3%(以4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3計)，總收率60.2%(以碘甲烷-D3計)。純度99.0%，豐度99.0%。ESI-MS：332.11(M+1)+,1H NMR(CDCl3，500 MHz)，3.86(s,3H)，4.52(d,J=1.8 Hz,2H)，4.54(br,1H)，6.57～6.62(m,3H)，6.92(s,H)，7.22～7.40(m,3H)，7.87(s,H)。

3 結果與分析

綜上分析，在化合物1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑的(8)的五步反應過程中，產物經鑒定為目標產物。第三步合成4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率初期探索時僅約50%，副產物多且影響下一步反應，其他幾步合成收率穩定，基本都大于85%，故第三步反應的收率對最終產品(8)的收率具有較大影響，對第三步反應的溫度、時間、投料比等條件進行優化。

3.1 合成收率影響因素

3.1.1反應溫度

反應溫度對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率影響較大，實驗中固定反應時間4 h，n(4-氟-2-甲氧基苯胺)：n1(溴丙炔)=1∶1.2，研究溫度變化對收率的影響，結果示于圖2。從圖2結果可知，當反應體系的溫度低于0 ℃時反應收率較低，其原因可能是溫度低，反應活性低，反應較難發生，收率低；當溫度高于50 ℃時，收率隨著溫度升高而降低，是因為溫度高容易發生溴丙炔的二取代反應，質譜上顯示有二取代的分子離子峰，并且液相上明顯二取代雜峰增大，造成收率低，因此優選反應溫度為50 ℃。

圖2 反應溫度對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率的影響Fig.2 Effect of temperature on synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

3.1.2反應投料比

為了提高4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的反應收率，研究4-氟-2-甲氧基苯胺-D3和溴丙炔的物質的量比對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3反應收率的影響，具體結果列于表1。由表1結果可知，當反應物質的量比達到1∶1.2時，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率達到最大。

表1 反應投料比對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率的影響Table 1 Effect of ratio on the synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

注：反應條件：反應時間4 h，反應溫度50 ℃；n∶n1=4-氟-2-甲氧基苯胺∶溴丙炔

3.1.3反應時間

固定反應物料比為1∶1.2，反應溫度為50 ℃，考察反應時間對合成4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的影響,實驗結果示于圖3。由圖3結果可以看出,隨著反應時間的增加，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率迅速提高，到4 h后基本趨于穩定,再延長時間，收率略有下降，其原因是反應時間過長導致溴丙炔二取代副產物的生成(質譜上顯示有二取代的分子離子峰，并且液相上明顯二取代雜峰增大)，綜合成本考慮，選擇較優的反應時間為4 h。

圖3 反應時間對4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3合成收率的影響Fig.3 Effect of reaction time on synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

3.2 結構表征

化合物(8)的1H NMR核磁譜圖分析示于圖4。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ3.82(s,3H)，3.84(s,3H)，4.52(d,J=1.8 Hz,2H)，4.54(br,1H)，6.57～6.62(m,3H)，6.92(s,H)，7.22～7.40(m,3H)，7.87(s,H)。譜圖積分為17個氫，結構上為17個氫，可見，合成產品的1H NMR與化合物(8)的結構吻合，確定產品是目標產物。

化合物(8)的LC-MS圖譜示于圖5，主峰m/z=332.11，為[M+H]峰，其質量數332.11≈331.10+1(331為化合物(8)相對分子質量)，結合核磁譜圖可以確認為目標化合物(8)，同位素豐度為99.0%。

圖4 化合物(8)的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR of compound (8)

3.3 活性測試

采用7sea-cell Counting Kit-8(CCK-8)染色法檢測化合物(8)的細胞活力。取活細胞比例達90%以上的細胞進行實驗。細胞增殖抑制試驗采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒。細胞消化、計數、制成濃度為1×105個/mL的細胞懸液，96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液(每孔1×104個細胞)；96孔板置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h；每孔加入100 μL含藥物的培養基，設立陰性對照組，溶媒對照組，陽性對照組，每組5復孔；96孔板置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養72 h后；每孔加入10 μL CCK-8溶液,將培養板在培養箱內孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的OD值，計算化合物(8)對人肺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2、人胃癌細胞MGC-803、人胃癌細胞MKN45等細胞的抑制率及IC50值。劑量設置：劑量1組：100 μmol/L；劑量2組：50 μmol/L；劑量3組：25 μmol/L；劑量4組：12.5 μmol/L；劑量5組：6.25 μmol/L；劑量6組：3.125 μmol/L；劑量7組：1.562 5 μmol/L；劑量8組：0.781 25 μmol/L；劑量9組：0.390 625 μmol/L；劑量10組：0.195 312 5 μmol/L；陽性對照：10 μg/mL。

圖5 化合物(8)的LC-MS譜圖Fig.5 The LC-MS ofcompound (8)

化合物(8)對腫瘤細胞的IC50值列于表2，表2結果表明，化合物(8)對A549、MGC803、MKN45、HepG2等表現出廣譜的抗腫瘤活性，具有成為抗腫瘤藥物的潛力。

表2 化合物(8)對腫瘤細胞的IC50值Table 2 The IC50 values of compound (8) to tumour cell

4 結論

本研究采用碘甲烷-D3為原料，經過甲基化、硝基還原、炔基取代、疊氮化以及環化反應合成1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑。該合成方法簡單而且穩定性高，以碘甲烷-D3計，目標產物總收率為60.2%，化學純度為99.0%，同位素豐度為99.0%。化合物具有廣譜抗腫瘤活性，有望成為抗腫瘤藥物。

參考文獻：

[1] It G R, Singh S B, Hamel E, et al. Isolation and structure of the strong cell growth and tubulin inhibitor combretastain A-4[J]. Experientia,1989, 45(2): 209-211.

[2] Gaukroger K, Hadfield J A, Lawrence N J, et al. Structural requirements for the interaction of combretastatins with tubulin: how important is the trimethoxy unit?[J]. Org Biomol Chem, 2003, 1(17): 3 033-3 037.

[3] Pettit G R, Minardi M D, Rosenberg H J, et al. Antineo plastic agents509:synthesis of fluorcombstat in phosphateandrelated 3-halostilbenes[J]. J Nat Prod, 2005, 68(10): 1 450-1 458.

[4] Pettit G R, Anderson C R, Herald D L, et al .Antineo plastic agents 487.synthesis and biological evaluation of the antineo-plastic agent 3,4-methylene dioxy-5,4′-dimethoxy-3′-amino-Z-stilbene and derived aminoacidamides[J]. J Med Chem, 2003, 46(4): 525-531.

[5] John J H, Madhavi S, Tracy E S, et al. Design, synthesis, biochemical, and biological evaluation of evaluation of nitrogen-containing trifluoro structural modifications of combretastain A-4[J]. Bioorg Med ChemLett, 2008, 18(18): 5 146-5 149.

[6] Maya A B S, Del Rey B, de Clairac R P L, et al. Design, synthesis and cytotoxic activities of naphthylanphthyl analogues of combretastain A-4[J]. Bioorg Med ChemLett, 2000, 10(22) : 2 549-2 551.

[7] Hu L, Li Z R,Wang Y M, et al. Novel pyridinyl and pyrimidinylcarbazole sulfonamides as antiproliferative agents[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2007, 17(5): 1 193-1 196.

[8] Ohsumi K, Nakagawa R, Fukuda Y, et al. Novel combretastatinananlogues effective against murine solid tumors: Design and structure-activity relationships[J]. J Med Chem, 1998, 41(16): 3 022-3 032.

[9] Pinney K G, Mejia M P, Villalobos V M, et al. Synthesis and biological evaluation of aryl azide derivatives of combretastatin A-4 as molecular probes for tubulin[J]. Bioorg Med Chem, 2000, 8(10): 2 417-2 425.

[10] Monk K, Siles R, Hadimani M B, et al. Design, synthesis, and biological evaluation of combretastatin nitrogen-containing derivatives as inhibitors of tubulin assembly and vascular disrupting agents[J]. Bioorg Med Chem, 2006, 14(9): 3 231-3 244.

[11] Hatanaka T, Fujita K, Ohsumi K, et al. Novel B -ring modified combretastatin analogues: Syntheses and an tineoplasticactivity[J]. Bioorg Med Chem Lett,1998,8(23): 3 371-3 374.

[12] Rao Y K, Fang S H, Tzeng Y M. Synthesis and biological evaluation of 3′,4′,5′-trimethoxychalcone analogues as inhibitors of nitric oxide production and tumor cell proliferation[J]. Bioorg Med Chem, 2009,17(23) : 7 909-7 914.

[13] 汪忠華. 一種1-取代苯基-4-取代苯胺甲基-1,2,3-三氮唑衍生物及其制備方法和用途:中國,201410834545.2[P].2014-12-23.

[14] 巫輔龍. 二苯基取代氨甲基三氮唑類化合物的合成和活性研究[D]. 上海：上海應用技術大學,2016.