實時定量PCR技術在本科實驗教學中的應用

李 欣, 趙玉紅, 趙立青, 張金紅, 李小菊, 張偉英, 石建黨

(南開大學 生命科學學院 生物實驗教學中心, 天津 300071)

實時定量PCR技術(real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR)是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術[1-2]，該技術是在常規PCR反應體系中加入熒光染料(染料法)或熒光標記的探針(探針法)，利用熒光信號積累實時監測PCR擴增反應并對模板初始量進行定量分析[3-4]，可用于檢測和比較多種樣本中的微量核酸，包括基因定量、基因分型和擴增特異性分析等，廣泛應用于醫學診斷、檢驗檢疫和環境微生物檢測等諸多領域[5-6]，同時也是分子生物學、遺傳學、細胞生物學等基礎學科研究中不可或缺的實驗技能。

近年來，如何在實驗教學中讓學生掌握科研工作中常用的基本實驗技術，培養學生的綜合能力和科研素養，促進教學與科研的相互融合已經成為實驗教學改革的重要課題[7]。為此，分子生物學實驗課程組設計了綜合性實驗“實時定量PCR分析不同濃度IPTG對啟動子活性的調節作用”，將實時定量PCR這一科研常用技術手段引入本科實驗教學。實驗首先對大腸桿菌進行不同濃度IPTG誘導培養，隨后分別提取細菌總RNA，經過反轉錄PCR后獲得cDNA，再以此為模板，選擇更具普適性的染料法(SYBR GreenⅠ)進行實時定量PCR。最后采用絕對定量分析模式計算出不同濃度IPTG誘導下目的基因mRNA水平的增加倍數，進而推算出相應啟動子利用效率的變化情況。

1 主要實驗儀器

NanoDrop 2000C超微量分光光度計、高速冷凍離心機、常規PCR儀；Roche LightCycler 480實時定量PCR儀、恒溫振蕩培養箱、DNA水平電泳設備，凝膠成像系統等。

2 主要實驗材料與試劑

含pGEX-4T-2/GAPDH質粒的大腸桿菌DH5α，RNAprep Pure細菌總RNA提取試劑盒，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，LightCycler 480 SYBR GreenⅠMaster，實時定量PCR引物(上游：5’-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’；下游：5’-CTGGAAAGCTGTGGCGTGATG-3’ )，TE Buffer(pH 8.0)，DNase/RNase-Free Deionized Water等。

3 實驗方法

3.1 大腸桿菌的誘導培養

將含pGEX-4T-2/GAPDH質粒的大腸桿菌DH5α接種于20 mL含有80 μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養，至OD600達0.6～0.8 h，分裝菌液至細菌培養管中，每管4 mL，共分4管，其中1管作為對照，不加IPTG誘導，另外3管加入IPTG至終濃度分別為0.1 mM、0.5 mM和1 mM。37 ℃，200r/min振蕩培養30 min。

3.2 大腸桿菌總RNA的提取

詳細操作步驟以RNAprep Pure細菌總RNA提取試劑盒說明書為準。

(1) 4支培養管各取1.5 mL菌液，4 ℃，12 000r/min，離心2 min收集菌體，棄掉上清；

(2) 重復上步操作一次，每種菌液共收集3 mL菌體；

(3) 用含有400 μg/mL溶菌酶的100 μL TE buffer重懸菌體，室溫孵育5 min；

(4) 加入350 μL裂解液，旋渦振蕩混勻；

(5) 加入250 μL無水乙醇，混勻后轉移至吸附柱(放于收集管中)，12 000 r/min，離心1 min，倒掉廢棄液；

(6) 吸附柱中加入350 μL去蛋白液，12 000r/min，離心1 min，倒掉廢棄液；

(7) 吸附柱中加入80 μL DNaseⅠ工作液，室溫靜置15 min；

(8) 重復步驟6；

(9) 吸附柱中加入500 μL漂洗液，室溫放置2 min，12 000 r/min，離心1 min，倒掉廢棄液；

(10) 重復上步操作一次；

(11) 12 000 r/min，離心2 min，倒掉廢棄液，將吸附柱置于室溫晾干；

(12) 將吸附柱轉入新的RNase-free離心管中，向吸附膜加入60 μL RNase-Free Deionized Water，室溫靜置2 min，12 000 r/min，離心2 min，即得到RNA溶液。

3.3 RNA的檢測

使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計對提取的4份RNA進行定量。隨后分別上樣4 μg進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，80 V，30 min。用凝膠成像系統進行觀察拍照。

3.4 反轉錄合成cDNA

3.4.1 反應體系

每種RNA樣品分別取2 μg進行反轉錄，用Nuclease-free Water補足體積至10 μL。按表1配制5份2×反轉錄反應體系的混合液，充分混勻后短暫離心，分裝于4個RNase-free的PCR管中，每管10 μL。再分別加入4種不同的RNA(2 μg/10μL)，充分混勻，最終配制完成4份20 μL 1×反轉錄反應體系。

表1 2×反轉錄反應體系

3.4.2 反應條件

將上述4份反應體系置于常規PCR儀上,設定反應條件為:25 ℃,10 min；42 ℃,60 min；80 ℃,10 min；4 ℃,forever。

3.5 實時定量PCR

3.5.1 準備不同濃度的標準品

用NanoDrop 2000C超微量分光光度計測定pGEX-4T-2/GAPDH質粒濃度,按如下公式換算成拷貝數:

拷貝數/μL=質粒濃度(ng/μL)×10-9×6.02×1 023/質粒堿基對數目總和×堿基對平均相對分子質量。本質粒的堿基對數目總和為5955，堿基對平均相對分子質量為660。

將質粒進行梯度稀釋,分別配制為5×104 拷貝/μL、5×105 拷貝/μL、5×106 拷貝/μL和5×107 拷貝/μL 4個濃度的標準品。

3.5.2 反應體系

反應樣品包括4個反轉錄產物、4個標準品和1個陰性對照，共9種,且每種樣品均需要做3個重復,共計27份反應體系。因此,先配制除表2中組分1以外的其他幾種組分的混合液(按30份計算),充分混勻后短暫離心,分裝為9份,63 μL/份,以對應9種樣品。在每份中分別加入7 μL的相應組分1,再次混勻,短暫離心,分裝至Roche 8連管中,20 μL/管,短暫離心。

表2 實時定量PCR反應體系

3.5.3 反應條件

將Roche 8連管放置于LightCycler 480實時定量PCR儀中。設置4步反應程序,具體參數如表3所示。

表3 實時定量PCR反應程序

反應結束后,選擇絕對定量分析模式對實驗結果進行處理。

4 實驗結果與分析

4.1 大腸桿菌總RNA的檢測

4.1.1 定量檢測

使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計對提取的RNA進行定量檢測。圖1是未經誘導的RNA樣品檢測結果。0.1 mM IPTG誘導、0.5 mM IPTG誘導和1 mM IPTG誘導的RNA樣品濃度分別為:281.4 ng/μL、366.1 ng/μL和316.8 ng/μL。

理論上,純RNA的A260/A280比值應該在2.0左右,比值較高可能是試劑殘留或RNA部分降解造成的,因此還須進一步通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA的提取質量進行檢測。

4.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

生物體內一般含有3種主要的RNA,即核糖體RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)和轉運RNA(tRNA),其中rRNA含量最多,提取細胞或組織總RNA所得最多的就是rRNA。大腸桿菌屬于原核生物,將其總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳,理論上應該看到3條帶23S、16S和5S rRNA。本實驗RNA樣品的電泳結果如圖2所示。

圖2 RNA瓊脂糖凝膠電泳結果

4份RNA樣品電泳結果都可以看到較為明顯的3條RNA 帶,從上到下依次為大腸桿菌的23S、16S和5S rRNA,根據各條帶的帶型和亮度,說明總RNA的提取質量較好。

4.2 實時定量PCR

4.2.1 PCR產物的熔解曲線

本實驗選用SYBR GreenⅠ染料法,相比探針法,染料法的反應特異性差,因此需要在實時定量PCR反應結束后,用Tm Calling分析方法觀察各擴增產物的熔解曲線,以考察產物的特異性,如圖3所示。

圖3 熔解曲線

從圖3中結果可以看出,擴增產物的熔解曲線只有單一峰,PCR過程中沒有非特異性擴增產物。由于擴增中可能產生的非特異性產物(如引物二聚體)的Tm值一般低于74 ℃,當將反應條件中的讀板溫度設置為85 ℃時,就可以有效避免這些非特異性產物對結果判定的影響。

4.2.2 擴增曲線與標準曲線

反應完畢后,所有樣品的擴增曲線如圖4所示。

圖4 擴增曲線

擴增曲線光滑平穩,“S”形完好,符合定量檢測要求。在此基礎上選擇絕對定量分析模式,軟件會根據標準品擴增曲線自動繪制出標準曲線,如圖5所示。

圖5 標準曲線

標準曲線中濃度Log值與閾值循環數CP(crossing point)線性關系良好,可以作為待測樣品定量分析的依據。

4.2.3 通過標準曲線得到的待測樣品拷貝數

根據標準曲線,軟件會自動給出各樣品中目的片段的起始濃度(拷貝數),見圖6。

圖6 絕對定量分析結果

根據圖6中“Mean conc”(平均濃度)一欄的數據可知,未經誘導的樣品目的片段起始濃度為4.27×105 拷貝/μL,經0.1 mM、0.5 mM和1 mM IPTG誘導后的樣品目的片段起始濃度分別為2.83×106 拷貝/μL,3.11×106 拷貝/μL和4.18×106 拷貝/μL。分別與對照組(未經誘導)相比,即可獲得不同濃度IPTG誘導下目的基因mRNA水平的增加倍數,進而推算出啟動子利用效率的變化情況。通過計算,經0.1 mM、0.5 mM和1mM IPTG誘導后，mRNA水平或啟動子利用效率分別是未經誘導時的6.6倍、7.3倍和9.8倍。即經過IPTG誘導,啟動子利用效率明顯提高。

5 注意事項

5.1 避免RNase污染

由于RNase基本上無處不在且很難滅活,因此在RNA提取時最好隔離出一個獨立的空間進行RNA提取實驗,且配備專用的移液器、離心機等設備,相關耗材如槍頭、離心管等也需選用RNase-free的。另外,在實驗中,操作人員應佩戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤加更換。

5.2 配制溶液必須充分混勻

實驗體系中頻繁涉及到溶液的配制和分裝,因此溶液的混勻操作對于整個實驗的精準度甚至成敗而言至關重要。如在進行梯度稀釋時,務必將上一濃度溶液混合均勻后再進行下一濃度稀釋；涉及多管反應配制混合液時,務必充分將各組分混合均勻后再分裝,既可以提高反應精度,還可以減少重復性操作和污染的可能。

5.3 對PCR污染的控制

從圖6的結果列表中可以發現,陰性對照中也出現了200多個目的片段拷貝,這說明反應體系中很可能存在一定程度的污染。由于實時定量PCR反應靈敏度很高,極微量的污染都會被放大,因此,在進行PCR時要注意以下幾點:

(1) PCR的不同處理步驟應盡量在相對獨立的區域進行,如模板處理區(進行模板的制備和加入)、溶液配制區(進行反應體系的配制)、PCR擴增區(進行PCR擴增)以及產物分析區(進行凝膠電泳分析和結果拍照),各工作區要有一定的隔離,且操作器材專用；

(2) 槍頭、離心管等耗材以及相關試劑不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染；

(3) PCR擴增所需要的試劑(如雙蒸水、引物等)均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝,每次實驗最好取用新打開的獨立小包裝；

(4) 反應體系中最后加入反應模板,加入后蓋緊反應管；

(5) 操作過程中避免反應液飛濺,若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面等。

5.4 注意試劑和產物的存放條件

該實驗過程所用試劑以試劑盒為主,在使用前應認真閱讀試劑盒使用說明書,并嚴格按照說明書上的要求存放相關試劑,如酶類需要分裝避免反復凍融、LightCycler 480 SYBR GreenⅠMaster需要避光等。另外,由于在教學過程中整個實驗需要分解在幾天中進行,若中間產物保存不當,必然會影響下一步乃至最終的實驗結果。對于離心收集的菌體,如暫時不提取RNA可以凍存于-70 ℃；對于提取獲得的RNA最好直接進行反轉錄,也可以存放于-20 ℃短時間保存。如果需要較長時間保存RNA,則可以在其中加入2.5倍體積的無水乙醇,混勻后保存于-70 ℃；對于反轉錄產物,最多可以在-20 ℃保存1周,如需保存更久,則需要放置于-70 ℃。

6 教學設計

該實驗項目具有較強的連貫性和綜合性,且實驗成本較高,對學生的理論知識和操作技能也都有較為嚴格的要求,而傳統的基礎實驗課程受眾面廣,學生水平參差不齊,且一定程度上受到課時和經費的限制,若在基礎實驗中開設這一項目,勢必會增加師生的教學負擔,影響實驗教學效果[8]。因此,課程組擬將該項目作為一個獨立的綜合性實驗,首先面向已具有分子生物學基礎的大三年級生物伯苓班開設。

生物伯苓班是南開大學入選國家“基礎學科拔尖學生培養試驗計劃”的生物學科人才培養試點班。伯苓班學生都是本著優中選優的原則層層選拔而來,無論是理論和操作基礎,還是學習的主動性和積極性等方面都有著明顯的優勢[9]。另外,伯苓班一直秉承著小班授課的獨立培養模式,且擁有學校劃撥的專項實驗課程經費作為保障,這些都為面向伯苓班開設本實驗項目創造了良好的條件。

不同于基礎驗證性實驗,綜合性實驗是模擬一個小型研究課題,教學模式是以學生為主體,教師為主導,給予學生更多的自主空間,以充分激發學生的主觀能動性[10-11]。實驗從細菌誘導培養開始,到最終推斷出啟動子的利用效率變化都由學生自行安排完成,教師只在這個過程中進行必要的講解、引導以及答疑解惑。實驗結束后,師生一起對實驗過程中出現的問題及實驗結果進行討論與點評,讓每個學生做到“知其然,且知其所以然”。最終的實驗報告要求以科研論文的形式提交。這一教學設計不但使學生能夠深入、全面、系統地掌握科研中常用的實時定量PCR技術及絕對定量分析方法,對于培養學生的科研思維、提高科研能力和科研素養更具有重要的實踐意義。

7 結語

將科研領域中的常用實驗技術改造成適合本科生實驗教學的實驗內容,一直是高等教育教學改革的研究熱點之一[12]。課程組開設“實時定量PCR分析不同濃度IPTG對啟動子活性的調節作用”這一綜合性實驗,旨在將實時定量PCR技術引入本科實驗教學。通過優化的實驗條件和合理的教學設計,不但可以讓本科生掌握該項技術的原理和操作要點、提高學生的實踐能力,更能夠在環環相扣的教學內容中訓練學生系統的科研思維以及嚴謹的科研素養,為提高本科實驗教學水平和人才培養質量、促進教學與科研相互融合奠定了良好的基礎。

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