一種H7N9禽流感病毒檢測質粒DNA標準物質的研制

許 麗， 李 妍， 王雪亮， 肖艷群， 劉 剛(. 上海市計量測試技術研究院 化學與電離輻射計量技術研究所， 上海 003;. 上海市臨床檢驗中心 分子生物學室， 上海 006)

0 引 言

中國國家衛生和計劃生育委員會于2013年3月31日首次通報，上海市和安徽省發現3 例人感染H7N9 禽流感病例。該疫情由H7N9病毒引起，每年都會在冬春季出現季節性流行，肺炎為其主要臨床表現，患者常出現發熱、咳嗽、咳痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛、腹瀉或嘔吐等癥狀。重癥患者病情發展迅速，多在發病3～7 d出現重癥肺炎。H7N9病例早期發病無特異性表現，早診早治困難，后期重癥病例治療效果差，病死率高，目前報告病例的總體病死率在40%左右[1-3]。疫情發生后，國家衛生與計劃生育委員會、疾病預防控制中心及時發布《人感染H7N9禽流感疫情防控方案》《人感染H7N9禽流感醫院感染預防與控制技術指南》和《人感染H7N9禽流感診療方案》[4]，世界衛生組織也于2013年4月發布《H7N9禽流感病毒的實時熒光RT-PCR檢測方案》[5]。

實時熒光反轉錄 PCR 方法(Real-time Reverse-transcription PCR, Real-time RT-PCR)可直接檢測H7N9病原體 RNA，具有快速、特異性強且不受樣品新鮮度限制的優點，且較常規PCR靈敏度更高、少污染、操作更便捷、反應更快速，可以為疾病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間，因此已經成為H7N9禽流感病毒檢測的重要方法。目前已有較多文獻報道使用實時熒光RT-PCR方法檢測 H7N9 病毒，也有相應的試劑盒研制成功并投放市場[6-12]。

在實際的實時熒光RT-PCR方法檢測過程中，常因RNA抽提失敗、反轉錄效率低、PCR體系中存在抑制劑等因素容易造成假陰性結果，需要使用核酸或病毒標準物質對其進行質量控制。但目前仍然沒有相關有證標準物質，各檢測單位在檢測時常采用病毒陽性樣本、提取的病毒RNA、非感染性體外轉錄RNA、自行研制的質粒DNA分子或試劑盒自帶的陽性標準品作為質控品，穩定性差、存在安全隱患、陽性樣品難以獲取且缺乏統一的定值方法、量值無法溯源，造成各實驗室之間的檢測結果差異大，缺乏可比性、有效性和可靠性。

本文以H7N9禽流感病毒為目標研制了一種質粒DNA標準物質，包含H7N9實時熒光RT-PCR檢測方法的靶標基因(血細胞凝集素HA基因和神經氨酸酶NA基因)以及內參基因(M基因、RnaseP基因)，適用于多種實時熒光RT-PCR檢測方法，并具有良好的序列準確度和量值可溯源性，可用于H7N9禽流感病毒實時熒光RT-PCR檢測結果的質量控制，保證檢測結果的可靠可比性，為其提供生物計量技術支持。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

限制性內切酶、全基因人工合成等(寶生物工程有限公司)；引物探針合成、Master Mix(Life technologies)；人感染H7N9禽流感病毒RNA檢測試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)；H7N9禽流感病毒cDNA，贈自軍事醫學科學院；DNA測序(寶生物生物工程有限公司、北京六合華大基因科技股份有限公司、上海百力格生物技術有限公司、鉑尚生物技術(上海)有限公司、上海立菲生物技術有限公司、上海美吉生物技術有限公司、上海生工生物技術有限公司、蘇州金唯智生物科技有限公司)。實驗中用到的引物和探針序列見表1。

實時熒光定量PCR儀(Life technologies)；微量核酸蛋白定量儀(nanodrop2000)；高分辨電感耦合等離子體質譜(Thermo Element 2)。

表1 實驗中的引物和探針序列[5]

1.2 質粒構建

在數據庫GISAID EpiFlu(http://platform.gisaid.org/epi3/frontend#4c6137)中查詢已經報道的H7N9禽流感病毒基因組序列，下載后選取若干病毒株序列進行比對。比對發現不同株病毒的序列有稍許變異，但是鑒于檢測H7N9的引物和探針多在其序列的較保守區域設計，且針對變異位點多設計了簡并堿基，所以選擇其中一株2013年在安徽省發現的病毒(isolate ID：EPI_ISL_138739)的序列進行克隆。選取H7N9禽流感病毒實時熒光RT-PCR檢測的靶基因(H7、N9基因序列)、內參基因(M基因)以及人類RnaseP基因序列，序列經軟件分析后在5′端和3′端加上合適的限制性內切酶位點。將修改后的序列進行全基因人工合成，并插入到克隆載體pMD19-T上，形成重組質粒。提取純化后的重組質粒送8家測序公司聯合測序驗證，確認靶基因序列被正確克隆。

1.3 質粒純度、均勻性及穩定性檢驗、定值方法、不確定度分析

采用已發表的方法[13]對質粒DNA標準物質的純度進行檢驗，參照JJF 1343-2012[14]及ISO Guide 35[15]對標準物質的瓶間均勻性、瓶內均勻性、短期穩定性及長期穩定性進行檢驗評價，并聯合多家實驗室對質粒DNA標準物質的濃度進行定值。使用兩種方法對質粒DNA標準物質的濃度進行定值[13]，一種為紫外分光光度法；另一種為高分辨電感耦合等離子體質譜，從三方面來源對質粒DNA標準物質的不確定度進行分析：① 標準物質的不均勻性引起的不確定度；② 標準物質在有效期內的變動性引起的不確定度；③ 標準物質的定值過程帶來的不確定度，包括數據統計引入的不確定度和通過對定值方法中測量影響因素進行分析評定的不確定度。

1.4 質粒DNA標準物質在實時熒光RT-PCR檢測中的應用性考察

采用兩種方式對質粒DNA標準物質的應用性進行考察：① 使用WHO推薦PCR方法對質粒DNA標準物質進行擴增；② 采用商業化H7N9禽流感病毒檢測試劑盒對質粒DNA標準物質進行擴增。擴增時采用H7N9禽流感病毒cDNA作為對照，觀察研制的標準物質是否與病毒cDNA擴增結果是否一致。

2 結果與討論

2.1 質粒構建

選取H7N9禽流感病毒實時熒光RT-PCR檢測的靶基因(H7、N9基因序列)、內參基因(M基因)以及人類RnaseP基因序列，全基因人工合成后克隆至載體pMD19-T上，形成重組質粒pXL12。經8家測序技術公司聯合驗證，質粒DNA標準物質pXL12的插入序列與設計克隆的H7基因、N9基因、M基因、RnaseP基因序列完全相符，準確率為100%。重組質粒圖譜見圖1，外源序列信息見表2。

2.2 質粒純度檢測

經瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法確認，質粒無其他DNA、RNA或蛋白質污染，純度符合要求。電泳結果見圖2，紫外分光光度法檢測結果:質粒DNA標準物質pXL12,A260/A2801.85,A260/A2302.06。

圖1 重組質粒圖譜

泳道M: λ-HindⅢ digest DNA marker; 泳道1: 未經酶切的環狀質粒pXL12; 泳道2:經KpnⅠ酶切后的線性質粒 pXL12

2.3 質粒均勻性及穩定性檢驗

經隨機抽樣檢測及結果統計學分析，本研究中的質粒DNA標準物質的瓶內均勻性、瓶間均勻性均符合標準物質研制要求[16]。經短期穩定性檢驗，該質粒DNA標準物質在20 ℃下保存10 d，量值保持穩定；經長期穩定性檢驗，該質粒DNA標準物質在-20 ℃條件下保存，在12個月內量值保持穩定。

2.4 質粒DNA標準物質定值和不確定度評估

研制的質粒DNA標準物質采用9家實驗室協同定值，匯總全部原始數據后經統計檢驗確認各組數據無離群值、各組數據等精度、每組數據的平均值之間不存在顯著性差異后，取9家實驗室檢測結果的平均值為各質粒DNA標準物質的標準值。

隨后對質粒DNA標準物質的不確定度進行評估，將均勻性引入的不確定度、穩定性引入的不確定度、定值過程引入的不確定對分量合成，得到最終質粒DNA標準物質的標準不確定度度。將質粒DNA標準物質特性量值標準值的合成標準不確定度乘以包含因子k(對應置信概率95%，取k=2)，即為質粒DNA標準物質特性量值標準值的擴展不確定度。質粒DNA標準物質不確定度分量為：質粒DNA標準物質pXL12，不均勻性引起的相對不確定度0.07%，在有效期內的變動性引起的相對不確定度0.4%，定值過程引入的相對不確定度1.2%，相對合成不確定度1.3%，標準不確定度1.35 mg/L。定值結果為：質粒DNA標準物質pXL12，定值結果104.0 ng/μL，DNA拷貝數濃度1.3×1010copies/μL，標準不確定度1.35 mg/L，相對擴展不確定度(k=2)2.6%。

2.5 質粒DNA標準物質在實時熒光RT-PCR檢測中的應用性考察

2.5.1使用WHO推薦PCR方法對質粒DNA標準物質進行擴增

合成WHO推薦方法中的4套引物探針，以梯度稀釋的質粒DNA標準物質(濃度從106～101copies/μL)為模板進行實時熒光PCR擴增。每個反應重復3次，根據不同濃度模板擴增的Ct值與濃度之間的關系，建立標準曲線。擴增結果及建立的標準曲線見圖3，結果顯示擴增成功，標準曲線相關系數均達到0.99，表明質粒DNA標準物質pXL12適合應用于該方法檢測，可作為實時熒光RT-PCR擴增H7N9禽流感病毒的陽性標準物質。

2.5.2使用試劑盒方法對質粒DNA標準物質進行擴增

目前商業化H7N9禽流感病毒檢測試劑盒常采用一步法RT-PCR，對人口咽拭子、鼻拭子以及痰液中H7N9禽流感病毒的H7基因及N9基因的特異性RNA片段進行熒光PCR定性檢測。選用上海之江生物科技股份有限公司生產的“人感染H7N9禽流感病毒RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)”試劑盒，使用該試劑盒的檢測方法對研制的質粒DNA標準物質進行擴增，同時以試劑盒自帶的陽性對照品及H7N9禽流感病毒cDNA為對照。擴增結果見圖4，可以看出，以研制的質粒DNA標準物質為模板時，H7及N9基因均有陽性擴增，與試劑盒自帶的陽性對照品及H7N9禽流感病毒cDNA的擴增結果一致，說明本質粒DNA標準物質可以適用于商業化試劑盒方法，用于H7N9禽流感病毒的熒光PCR定性檢測。

3 結 語

本研究中H7N9禽流感病毒檢測質粒DNA標準物質包含目前檢測方法中常見的靶標基因序列及內參基因序列，序列正確，適用于多種檢測方法。該標準物質的純度良好，均勻性、穩定性滿足JJG 1006-1994《一級標準物質技術規范》要求。該標準物質為核酸分子，不具有生物危害，可以替代病毒陽性樣本等高危標準品，保障檢測人員的生命安全。該標準物質的研制為H7N9禽流感病毒實時熒光RT-PCR檢測提供了量值溯源的依據，為H7N9禽流感病毒檢測實驗室質量控制提供有力保障。相信通過相應標準物質在我國H7N9禽流感病毒檢測實驗室的推廣應用，能夠進一步提高H7N9禽流感病毒檢測實驗室相關項目的檢測水平，保障各實驗室測量結果的可比性、準確性，為檢驗結果的互認和共享打下了良好的基礎。本標準物質的研制方法也為病毒檢測領域的質粒DNA標準物質提供一種可行的研制模式，為質粒DNA標準物質在病毒檢測領域的應用研究打下了良好的基礎，對于其他病毒檢測質粒DNA標準物質的研制也有參考意義。

參考文獻(References)：

[1] Tang R B, Chen H L. An overview of the recent outbreaks of the avian-origin influenza A (H7N9) virus in the human.[J]. Journal of the Chinese Medical Association Jcma, 2013, 76(5):245.

[2] 陳執中. H7N9禽流感病毒及抗病毒藥物研究進展[J]. 食品與藥品, 2013(4):288-291.

[3] 張 寶, 黃克勇, 郭勁松,等. H7N9病毒的來源和重組模式[J]. 南方醫科大學學報, 2013, 33(7):1017-1021.

[4] 國家衛生和計劃生育委員會. 人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第2版)[J]. 中華臨床感染病雜志, 2013, 6(2):65-67.

[5] 世界衛生組織(WHO). Real-time RT-PCR Protocol for the Detection of Avian Influenza A(H7N9) Virus (Updated on 15 April 2013) [R]. 2013.

[6] 董曉毅, 孫長貴. H7N9禽流感病毒感染及其實驗室診斷[J]. 實驗與檢驗醫學, 2013, 31(2):105-107.

[7] Wong C K, Zhu H, Li O T,etal. Molecular detection of human H7N9 influenza A virus causing outbreaks in China[J]. Clinical Chemistry, 2013, 59(7):1062-7.

[8] Li Y, Wu T, Qi X,etal. Simultaneous detection of hemagglutinin and neuraminidase genes of novel influenza A (H7N9) by duplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction[J]. Journal of Virological Methods, 2013, 194(1-2):194-196.

[9] Spackman E, Senne D A, Myers T J,etal. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40(9):3256.

[10] 羅思思, 謝芝勛, 劉加波,等. H7N9亞型AIV雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 動物醫學進展, 2013(12):1-5.

[11] 華哲云, 褚 維, 宋黎黎,等. 實時熒光RT-PCR在人感染H7N9禽流感病毒檢測中的應用[J]. 檢驗醫學, 2013, 28(9):755-757.

[12] 張嚴峻, 李 輝, 茅海燕. 禽流感h7n9病毒rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法[P]. 中國專利：CN 103276109 A. 2013.

[13] 許 麗, 梁 文, 李 妍,等. 4種阪崎腸桿菌檢測質粒DNA標準物質的研制[J]. 實驗室研究與探索, 2016, 35(3):4-8.

[14] JJF 1343-2012， 標準物質定值的通用原則及統計學原理[S].

[15] ISO Guide 35， Reference materials-General and statistical principles for certification [S].

[16] JJG 1006-1994，一級標準物質技術規范[S].