NEDD9表達變化與神經膠質瘤的惡性表型及不良預后的關系

姜紅升，周彩鳳，王艷洲，邢曉鋒，于金然

(1.滄州市中心醫院神經外四科；2.滄州市中心醫院教學處，河北 滄州 061000)

神經膠質瘤是最常見的腦腫瘤，也是中樞系統常見的惡性腫瘤，可占到顱內腫瘤的一半左右，常在功能區呈浸潤性生長[1]。臨床上，常采用手術、放化療或綜合治療等手段對神經膠質瘤進行治療，以手術為主要治療手段，但手術治療很難一次性徹底完整切除，尤其對惡性程度高的神經膠質瘤，其預后仍不理想，復發率較高，患者生存期較短[2]。神經元細胞表達發育下調基因9(NEDD9)屬于一種局灶性粘附骨架蛋白，最早在期胚胎小鼠的大腦組織中被發現，在細胞的分化、轉移及凋亡中起重要作用，在調節蛋白復合物，控制細胞轉移、趨化、調亡、細胞周期和分化中起重要的作[3]。相關研究[4]表明，NEDD9的高表達與大腦膠質瘤、皮膚黑色素瘤及乳腺癌等多種腫瘤的不良預后有密切關系。本研究通過分析NEDD9表達變化與神經膠質瘤的惡性表型及不良預后的關系，為尋找膠質瘤新標志物奠定基礎，為臨床客觀、準確判斷患者預后提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年10月至2012年10月滄州市中心醫院收治的神經膠質瘤患者100例作為研究對象，納入標準：(1)符合神經膠質瘤診斷標準[5]；(2)患者均為首次手術治療，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤患者術后給予替莫唑胺輔助化療；(3)術前未接受放化療；(4)簽署知情同意書。根據病理診斷惡性程度分為低度惡性組(WHO分級為Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤)和高度惡性組(WHO 分級為Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤)，每組各50例，同時收集因重度顱腦外傷患者50例作為對照組。低度惡性組中：男性32例，女性18例，年齡30～68歲，平均(46.24±6.82)歲；高度惡性組中：男性33例，女性17例，年齡32～67歲，平均(45.85±7.36)歲；正常對照組中：男性30例，女性20例，年齡30～69歲，平均(46.16±7.35)歲。各組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，研究經本院倫理委員會審批并通過。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 神經膠質瘤患者手術切除的膠質瘤標本，對照組行內減壓而切除的腦組織，置入液氮中冰凍，并存放于-80℃冰箱備存，所有標本都用石蠟包埋。

1.2.2 免疫組化法檢測NEDD9表達情況 采用免疫組織化學方法觀測腦組織標本中NEDD9的表達，使用切片機(德國Leica公司)將石蠟包埋組織切成4 μm厚度，二甲苯液脫蠟后依次采用95%、90%、85%乙醇水化，蒸餾水浸泡5 min后加入3%過氧化氫溶液50 μL，20 ℃下孵育10 min， PBS沖洗3次，加入50 μL的一抗4 ℃下過夜后，加入二抗20 ℃下孵育10 min，采用DBA試劑盒(美國KPL公司)中的試劑進行顯色，放入顯微鏡下觀察，顯色后用蒸餾水洗掉，終止顯色，采取蘇木素復染2 min，中性樹膠封片。

1.2.3 NEDD9 mRNA及蛋白表達檢測 采用qRT-PCR技術檢測腦組織NEDD9 mRNA的表達：(1)從冰箱中取出標本組織20 mg，研磨成粉末狀；(2)嚴格按照Trizol試劑(美國 Invitrogen 公司)說明書提取組織總RNA；(3)采用反轉錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)配置反應混合物，反轉錄合成環狀DNA；(4)熒光實時定量RT-PCR反應反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s， 60 ℃退火30 s，40個循環，相關引物序列(上海生工公司)見表1；(5)PCR產物經EB染色和2%瓊脂糖凝膠電泳后，采用紫外分析儀進行觀察，并采用HMIAS-2000系統進行定量分析，用NEDD9 mRNA與GAPDH的灰度比值表示NEDD9 mRNA的相對表達水平。采用Western-blot法檢測腦組織NEDD9蛋白的表達：(1)采用改良異硫氰酸胍法提取腦組織總蛋白，-70℃下凍存；(2)將40 μg總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離蛋白；(3)將蛋白質轉印到硝酸纖維素膜(NC膜)上；(4)NC膜置入封閉液中振蕩封閉30 min(室溫20℃)，漂洗3次(每次30 min)后加入NEDD9抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG稀釋液搖勻后，采用免疫熒光增強法(ECL)試劑盒(北京普利萊基因有限公司)檢測NEDD9蛋白的表達，同樣的方法檢測β-actin的表達作為內參照。

表1 NEDD9與GAPDH引物序列表

1.3 評價標準

采用免疫組織化學的方法對腦組織的NEDD9蛋白表達情況進行檢測，以陽性細胞數占總數的比率和染色強度進行評分：(1)0分：無陽性細胞；(2)1分：陽性細胞百分比<5%；(3)2分：5%<陽性細胞百分比≤20%。(4)3分：陽性細胞百分比>20%；對染色強度進行評分：(1)0分：無染色；(2)1分：淡黃色；(3)2分：棕黃色；(4)3分：棕褐色。將兩者的評分相乘得到總分，并將總分>4分定義為高表達，總分≤4分定義為低表達[6]。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 免疫組織化學法結果比較

免疫組織化學染色實驗結果顯示，在對照組的腦組織中NEDD9蛋白的表達極低，在低度惡性組和高度惡性組中NEDD9表達較高，且高度惡性組明顯高于低度惡性組(圖1)。免疫組織化學評分結果顯示，對照組、低度惡性組和高度惡性組的NEDD9蛋白評分為1.89±0.42、3.12±1.03、8.12±1.03，對照組<低度惡性組<高度惡性組(P<0.05)。

2.2 各組NEDD9 mRNA及蛋白表達情況

RT-PCR結果顯示，對照組、低度惡性組和高度惡性組的NEDD9 mRNA相對表達量為0.23±0.07、0.42±0.08、0.79±0.12，對照組<低度惡性組<高度惡性組(P<0.05)；Western-blot結果顯示，見圖2。

2.3 患者5年生存情況比較

NEDD9高表達組患者平均生存時間為26.35個月(95%CI 20.15～29.94)，NEDD9低表達組患者平均生存時間39.94個月(95%CI 32.25～46.38)，低表達組5年生存時間明顯高于高表達組(χ2=9.876，P<0.001)，見圖3。

2.4 神經膠質瘤患者5年總生存時間的相關因素分析

多因素COX回歸分析顯示，惡性程度(HR=1.936，P=0.007)、腫瘤全切除(HR=1.073，P=0.018)、NEDD9蛋白表達(HR=2.415，P=0.009)是神經膠質瘤患者5年總生存時間的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 神經膠質瘤患者5年總生存時間COX回歸分析

因素HR95%CIP值年齡(<60歲/≥60歲)1.1230.675～1.9520.107性別(男/女)0.7530.207～0.9590.153腫瘤部位1.3151.106～3.8540.348惡性程度(低/高)1.9361.396～3.5420.007腫瘤全切除1.0731.005～2.2120.018NEDD9蛋白表達(低/高)2.4151.103～5.3470.009

3 討論

神經膠質瘤屬于臨床最常見的腦腫瘤，是起源于膠質細胞的神經外胚層腫瘤，通常生長部位較深，且呈浸潤性的生長，具有難以治愈、病程短、患者生存質量差及死亡率高的特點[7]。神經膠質瘤臨床主要表現為：頭痛、惡性嘔吐、神經功能缺失、視乳頭水腫、偏癱、精神性格改變及共濟失調等，易出現遠處轉移[8]。目前對神經膠質瘤首選的治療手段為手術切除，但術后半年左右易復發，此時患者神經功能損傷加重，神經結構破壞范圍擴大，患者意識水平下降，最終誘發腦功能衰竭進而發生死亡[9]。惡性程度高的患者預后極差，其平均中位生存期通常約一年左右[10]。

上個世紀90年代初，NEDD9首次被提出，其又稱Cas-L，屬于骨架蛋白的CAS家族蛋白成員，在介導細胞信號轉導中起到重要作用[11]。NEDD9在多種腫瘤的發生發展中起作用，其可與多個細胞信號通路(BCAR3、CHAT-H、AND-34等)發生作用，促進腫瘤細胞趨化、遷移、侵襲和轉移[12]。本研究經免疫組織化學法實驗結果顯示，在對照組腦組織中NEDD9蛋白的表達極低，在低度惡性組和高度惡性組中NEDD9表達較高，尤其在高度惡性膠質瘤組織中呈高表達狀態，這是因為NEDD9是前致癌基因FAK激酶的特異性效應分子，其通過對蛋白復合體(Fascin蛋白)進行調節，調控細胞的粘附、遷移和侵襲、凋亡及細胞周期，從而促進腫瘤細胞遷徙及侵襲。高表達的NEDD9可導致Fascin蛋白發生結構性重組，促使應力纖維性結構形成，從而實現細胞骨架重塑，破壞細胞間及細胞與細胞外基質間的正常粘附性，使細胞粘附性下降，細胞的運動性增強，促進腫瘤細胞遷移侵襲能力增強，隨著NEDD9持續的高表達，最終膠質瘤惡性演變[13-14]。

本研究經qRT-PCR和Western blot實驗結果顯示，NEDD9 mRNA及蛋白相對表達量在各種的表達為：對照組<低度惡性組<高度惡性組(P<0.05)，這說明了NEDD9 mRNA及蛋白相對表達量與神經膠質瘤的惡性演變有關，在正常腦組織中其表達很微弱，隨著神經膠質瘤的惡性的遞進而呈上調趨勢，且在高度惡性膠質瘤中呈高表達狀態。NEDD9會提高與細胞外基質的結合，促進腫瘤細胞的生長增殖，當NEDD9呈高表達時，會激活一些下游效應分子(氨基端激酶、細胞外信號調節激酶及絲裂原激活的蛋白激酶等)，從而促進細胞遷移及侵襲，同時NEDD9也會刺激細胞產生更多的金屬蛋白酶 2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶 9(MMP-9)，而MMP-2或MMP-9會降解細胞基質，進一步增加生長因子及細胞因子的作用，促進惡性腫瘤的侵襲轉移[15]。因此臨床上可通過基因靶向治療下調NEDD9 的表達水平來削弱腫瘤細胞的轉移能力，阻斷或延緩神經膠質瘤的惡性演變進程。

本研究通過對神經膠質瘤患者預后影響因素進行分析，Cox回歸多因素分析結果顯示，NEDD9蛋白表達(HR=2.415，P=0.009)是神經膠質瘤患者5年總生存時間的獨立危險因素(P<0.05)，膠質瘤生存率會隨其惡性程度的升高而降低，這與國內外相關研究結果相一致，是影響患者預后的危險因素，并意味著NEDD9可能是一個有用的神經膠質瘤標志物，可作為一個獨立的患者預后指標。

綜上所述，NEDD9表達程度與神經膠質瘤發生發展關系密切，在膠質瘤的惡性進展中扮演重要角色，NEDD9高表達可預測神經膠質瘤患者長期不良預后。

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