銅綠假單胞菌外膜蛋白F與HSV-1VP22融合DNA疫苗的構(gòu)建與表達(dá)

楊勤，雍熙，李婷婷，余嫻，雷軍

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血管外科；3.川北醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，四川 南充 637000；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400010；5.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是臨床常見(jiàn)的多重耐藥菌之一，該菌對(duì)抗生素耐藥性呈逐年上升趨勢(shì)，臨床可選用的抗生素也越來(lái)越有限[1]。因此，研究者們將目光投向了針對(duì)該菌外膜蛋白F(OprF)的DNA疫苗。有研究表明OprF同時(shí)具有B細(xì)胞表位及T細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。但是，免疫反應(yīng)太弱限制了對(duì)其的進(jìn)一步研究[2-3]。I型單皰病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)間層蛋白VP22是一種高效的細(xì)胞穿透肽(CPPs)[4]，有研究[5-6]表明與VP22蛋白融合表達(dá)后，抗原蛋白能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，彌補(bǔ)裸露DNA疫苗免疫原性差的缺點(diǎn)。本研究通過(guò)構(gòu)建OprF/VP22融合表達(dá)的真核質(zhì)粒，驗(yàn)證重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，為進(jìn)一步研究重組DNA疫苗的體內(nèi)免疫反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

銅綠假單胞菌(ATCC27853)及非洲綠猴腎細(xì)胞系Vero由本實(shí)驗(yàn)室保存；6～8周齡BALB/c雌性小鼠購(gòu)自川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；pGEX-C45(pGEX-5X-1與編碼VP22蛋白碳端的257-301氨基酸殘基的基因片段的連接)和pcDNA3-VP22(pcDNA3與HSV-1編碼VP22蛋白的UL49基因的連接，酶切位點(diǎn)為EcoRI，)由余嫻教授惠贈(zèng)[7]；PVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自贏潤(rùn)生物公司；BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ購(gòu)自fermentas公司；Quick T4 DNA Ligase購(gòu)自Cell Biolabs公司；引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、抗OprF抗血清(兔源性)以及pVAX1-OprF-VP22和pVAX1-VP22-OprF的具體構(gòu)建由上海生物工程公司完成；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠/兔IgG、抗β-Actin小鼠單克隆抗體、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、DAB顯色試劑盒、苯甲基磺酰胺、內(nèi)參Actin抗體、Western Blot試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；質(zhì)粒提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自北京天根公司；蛋白酶K購(gòu)自BIO BASIC公司；溶菌酶購(gòu)自Merck公司；TtansIT-LT1 Reagent 2300購(gòu)自Mirus公司；DL2,000DNA Marker、DNA片段回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自Thermo公司；佐劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA疫苗載體的構(gòu)建 (1)pVAX1-OprF的構(gòu)建：首先提取銅綠假單胞菌(ATCC27853)的基因組，然后根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則和編碼OprF蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物P1：5′-CGCGGATCCAAGATGAAACTGAAGAACAC-3′(下劃線處為BamHI酶切位點(diǎn))；下游引物P2:5′-CCGCGAATTCTTACTTGGCTTCAGCTTCT-3′(下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增片段大小1 053 bp。以銅綠假單胞菌基因組為模板，擴(kuò)增編碼OprF的基因序列，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min結(jié)束。PCR產(chǎn)物純化回收后，與質(zhì)粒pVAX1分別經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E。coliDH5α，經(jīng)Kana+(50 g/mL)抗性篩選陽(yáng)性克隆，純化回收質(zhì)粒，雙酶切鑒定，并送測(cè)序。(2)pVAX1-VP22的構(gòu)建：直接用EcoRI單酶切pcDNA3-VP22，獲得編碼VP22蛋白的UL49基因，大小為906 bp，然后將其連入真核載體pVAX1，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)Kana+(50 g/mL)抗性篩選陽(yáng)性克隆，純化回收質(zhì)粒，分別經(jīng)EcoRI及XhoI單酶切鑒定，并送測(cè)序。(3)pVAX1-VP22-OprF的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則和編碼VP22蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物P3：5′-TATAAGCTTATGACCTCTCGCCGCTCCGT-3′(下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn))；下游引物P4：5′-AATTAGGATCCTAACTCGACGGGCCGTCTG-3′(下劃線處為BamHI酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增片段大小906 bp。以pcDNA3-VP22為模板，擴(kuò)增編碼VP22的基因序列。PCR產(chǎn)物純化回收后，與重組質(zhì)粒pVAX1-OprF分別經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)Kana+(50 g/mL)抗性篩選陽(yáng)性克隆，純化回收質(zhì)粒，雙酶切及測(cè)序鑒定，具體操作由上海生物工程公司完成。(4)pVAX1-OprF-VP22的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則和編碼OprF蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物P5：5′-GCCAAGCTTAGCATGAAACTGAAGAACAC-3′(下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn))；下游引物P6：5′-TCAATGGATCCACTTGGCTTCAGCTTCTA-3′(下劃線處為BamHI酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增片段大小1 053 bp。以pVAX1-OprF為模板，擴(kuò)增編碼OprF的基因序列。PCR產(chǎn)物純化回收后，與重組質(zhì)粒pVAX1-VP22分別經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)Kana+(50 g/mL)抗性篩選陽(yáng)性克隆，純化回收質(zhì)粒，雙酶切及測(cè)序鑒定，具體操作由上海生物工程公司完成。

1.2.2 抗VP22抗血清的制備及鑒定 (1)GST-C45融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將重組質(zhì)粒pGEX-C45和空載體pGEX-5X-1(作為對(duì)照)，分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DB3)，涂布于Amp+(100 g/mL)抗性的LB平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；然后分別挑取pGEX-C45和pGEX-5X-1的單菌落于3 mL Amp+抗性的2YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；以1∶20的比例接種于100 mL Amp+抗性的2YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)約3 h至OD 600達(dá)0.5～0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h；4 ℃、800 r/min離心10 min，沉淀用400 L的PBS(pH7.4)重懸，收集菌體。(2)GST-C45融合蛋白的分離純化：在上述收集到的菌液中加入溶菌酶及蛋白酶抑制劑，冰浴30 min后行超聲破碎(300 W，10 s 超聲，10 s間隔，30次循環(huán))，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分別收集上清液及沉淀包涵體。然后向收集到的沉淀包涵體中加入濃度為6 mol/L的尿素2 mL，42 ℃放置30 min，待蛋白溶解后8 000 r/min離心10 min，吸取上清。將兩次收集到的上清混合，以15 L分裝上清混合物，并加入等體積的2×裂解上樣buffer，沸水放置10 min后行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭染色，對(duì)照蛋白預(yù)染Marker，切取相應(yīng)大小的蛋白凝膠條帶放入已經(jīng)處理好的透析袋內(nèi)，加入適量1×Tris甘氨酸電泳緩沖液，兩端用夾子夾緊，4 ℃、100 V電泳3 h；反轉(zhuǎn)電壓正負(fù)極，4 ℃、100 V電泳1 min，吸取蛋白溶液，將-20 ℃預(yù)冷的5倍體積的丙酮緩慢加入蛋白溶液內(nèi)，-20 ℃放置30 min，4 ℃、12 500 r/min離心20 min，移去上清，待殘余丙酮揮發(fā)后用雙蒸水重懸沉淀，得到純化的融合蛋白；用BCA法測(cè)定純化后的VP22蛋白，濃度為320 g/mL，將其稀釋至200 g/ml，凍存于-70 ℃冰箱備用。(3)抗VP22抗血清的制備：隨機(jī)抽取10只BALB/c雌性小鼠，其中5只作為實(shí)驗(yàn)組，5只作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組首次免疫取100 g純化的融合蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化，然后腹部皮下多點(diǎn)免疫小鼠，初次免疫后的第2、4、6周取50 g純化的融合蛋白與弗氏不完全佐劑乳化加強(qiáng)免疫。對(duì)照組以生理鹽水代替純化后的融合蛋白免疫小鼠，其余條件不變。第4次免疫后7天眼內(nèi)眥取血。靜止離心后分離血清收集抗體。將實(shí)驗(yàn)組收集到的血清命名為陽(yáng)性血清，對(duì)照組收集到的血清命名為陰性血清。(4)Western blot檢測(cè)抗VP22抗血清：首先將收集到的陽(yáng)性血清與純化后的GST-C45融合蛋白行Western blot檢測(cè)。以脂質(zhì)體法將pcDNA3-VP22轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，用陽(yáng)性抗血清作為一抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)；同時(shí)取陰性血清為一抗作為對(duì)照。

1.2.3 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 將實(shí)驗(yàn)組分為pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22，以脂質(zhì)體法將分別將其轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。轉(zhuǎn)染pVAX1-VP22時(shí)用抗VP22抗血清作為一抗，同時(shí)轉(zhuǎn)染pVAX1作為對(duì)照；轉(zhuǎn)染pVAX1-OprF、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22時(shí)以抗OprF抗血清作為一抗，同時(shí)轉(zhuǎn)染pVAX1作為對(duì)照。待培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)Vero細(xì)胞長(zhǎng)至60～70時(shí)，分別取5 g重組質(zhì)粒pVAX1-OprF、pVAX1-VP22、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22與15 L TtansIT-LT1 Reagent 2 300加入500 L無(wú)血清無(wú)雙抗細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后室溫放置20 min，然后將形成的DNA脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；同時(shí)轉(zhuǎn)染pVAX1作為參照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72 h，用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，Western封閉液1 h，一抗4 ℃搖床過(guò)夜孵育，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pVAX1-OprF經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后得到大小1 053 bp的目的基因條帶(圖1A)，DNA序列測(cè)定證實(shí)該重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VP22經(jīng)EcoRⅠ酶切后得到大小為906 bp的片段(圖1B)，由于目的片段可以以正向或反向連入載體，依據(jù)載體及目的片段的酶切位點(diǎn)特性，選擇酶切位點(diǎn)XhoⅠ作進(jìn)一步檢測(cè)。正向連接產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ酶切后可得到大小為75 bp和39 bp的條帶，電泳時(shí)由于分子量太小而不可見(jiàn)；反向連接產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ酶切后會(huì)出現(xiàn)大小為846 bp的條帶。實(shí)驗(yàn)中以XhoⅠ單酶切重組質(zhì)粒pVAX1-VP22時(shí)并未觀察到反向連接時(shí)會(huì)出現(xiàn)的846 bp條帶(圖1C)，說(shuō)明VP22基因片段正向連入了載體pVAX1。DNA序列測(cè)定證實(shí)該重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 抗VP22抗血清的制備及鑒定

2.2.1 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化 將空載體pGEX-5X-1和重組質(zhì)粒pGEX-C45分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌，IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)12%SDS-PAGE分析表明，與空載體組相比，pGEX-C45額外表達(dá)了分子量大小約為30 kD的蛋白條帶，大小與預(yù)期一致(圖2A)。將重組質(zhì)粒的原核表達(dá)產(chǎn)物行12%SDS-PAGE電泳，切取相應(yīng)大小的蛋白凝膠條帶，電洗脫得到純化的GST-C45融合蛋白。經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后可得到單一且位置正確的條帶(圖2B)。BCA法測(cè)得純化的GST-C45融合蛋白濃度為320 μg/mL，將其稀釋至200 g/mL，用于免疫BALB/c小鼠制備抗VP22抗血清。

2.2.2 抗VP22抗血清的特異性鑒定 將純化后的GST-C45融合蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，以抗VP22抗血清為一抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，在分子量約30 kD處可見(jiàn)一特異性條帶，與預(yù)期一致，表明制備的抗VP22抗血清可特異性識(shí)別純化后的GST-C45融合蛋白(圖3A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗VP22抗血清的特異性，通過(guò)轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒pcDNA3-VP22，以抗VP22抗血清(陽(yáng)性血清)為一抗，進(jìn)行Westem blot檢測(cè)，在分子質(zhì)量約30 kD處可見(jiàn)一特異性條帶；以陰性血清作為一抗時(shí)則無(wú)特異性條帶產(chǎn)生(圖3B)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)證明：制備的抗VP22抗血清可特異性識(shí)別VP22蛋白，該抗血清可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)重組真核質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。

2.3 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒的體外表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，將重組質(zhì)粒pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22 、pVAX1-VP22-OprF分別轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，在相對(duì)分子量35 kD處可見(jiàn)VP22蛋白的特異性條帶，在相對(duì)分子量37 kD處可見(jiàn)OprF蛋白的特異性條帶，以及在相對(duì)分子量70 kD處可見(jiàn)VP22-OprF和OprF-VP22融合表達(dá)的特異性蛋白條帶，而對(duì)照組無(wú)特異性條帶產(chǎn)生(圖4)。

3 討論

OprF是銅綠假單胞菌外模上的主要非特異性通道蛋白，在遺傳上具有高度保守性，免疫原性相對(duì)較強(qiáng)，是極具潛力的疫苗候選分子[8]。已有研究表明在人體試驗(yàn)和動(dòng)物模型中，OprF可誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，但免疫反應(yīng)太弱而無(wú)法預(yù)防細(xì)菌感染的發(fā)生。Price等[9]將OprF基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒Pvr1020，成功構(gòu)建了Pvr 1 020/OprF DNA疫苗。在銅綠假單胞菌導(dǎo)致的小鼠慢性肺部感染的模型中，該重組質(zhì)粒可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，但是與空載體組相比保護(hù)力并無(wú)明顯差異。研究者們采取許多辦法以期增強(qiáng)OprF的免疫原性，如Westritschnig等[10]制備了銅綠假單胞菌OprF及OprI融合表達(dá)的DNA疫苗，免疫原性雖有所提高，但是免疫預(yù)防的效果仍有待提升。目前尚無(wú)防治銅綠假單胞菌感染的疫苗問(wèn)世[11]。

在DNA疫苗的研究領(lǐng)域，細(xì)胞穿透肽VP22顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。VP22蛋白可將與融合的編碼特異性抗原的基因片段以高效跨膜的方式轉(zhuǎn)運(yùn)至周?chē)目乖岢始?xì)胞，增強(qiáng)抗原的表達(dá)，誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)[12]。Kim等[13]構(gòu)建了人乳頭瘤病毒E7基因與編碼HSV-1 VP22蛋白UL49基因融合表達(dá)的重組真核質(zhì)粒，將其免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，與只編碼E7基因的重組質(zhì)粒相比，融合表達(dá)后的DNA疫苗可引起更明顯的T淋巴細(xì)胞毒性反應(yīng)，說(shuō)明VP22顯著增強(qiáng)了此DNA疫苗的免疫原性。

盡管已有研究表明VP22 羧基端是其發(fā)揮細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)功能的重要結(jié)構(gòu)域[4,14]，但是為了確保實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，排除蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)差異可能對(duì)疫苗免疫效果造成的影響，實(shí)驗(yàn)中我們同時(shí)設(shè)計(jì)了pVAX1-OprF-VP22與pVAX1-VP22-OprF兩種重組DNA疫苗作為研究對(duì)象。而pVAX1-OprF與pVAX1-VP22的成功構(gòu)建，為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中起到了很好的對(duì)照作用。另外，本研究利用原核表達(dá)載體pGEX-C45，誘導(dǎo)表達(dá)VP22碳端第257～301氨基酸殘基，獲得重組蛋白GST-C45抗原標(biāo)準(zhǔn)品，制備抗VP22抗血清，經(jīng)Western blot證實(shí)該多抗血清可與VP22蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。

本研究將pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22 、pVAX1-VP22-OprF依次轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空載體pVAX1作為對(duì)照組。通過(guò)Western blot觀察到重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)都得到了表達(dá)。pVAX1-VP22表達(dá)了相對(duì)分子量約35 kD的蛋白。pVAX1-OprF表達(dá)了相對(duì)分子量約37 kD的蛋白。而pVAX1-OprF-VP22和pVAX1-VP22-OprF都表達(dá)了相對(duì)分子量約70 kD的蛋白，與預(yù)期一致，推測(cè)此蛋白即為OprF與VP22融合表達(dá)的結(jié)果。這些結(jié)果均說(shuō)明無(wú)論是VP22和OprF的單獨(dú)基因片段，還是二者的融合質(zhì)粒，都能在真核細(xì)胞中得到表達(dá)。但是pVAX1-OprF-VP22 與pVAX1-VP22-OprF是否能如預(yù)期一樣較pVAX1-OprF誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，以及誰(shuí)才是最優(yōu)的疫苗分子，有待進(jìn)一步的研究。

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