重組人干擾素α-2b脂質體的制備及其家兔體內藥動學研究

楊 杰

0 引言

干擾素(Interferon,IFN)是人體細胞分泌的一種活性蛋白質，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用，是人體預防系統的重要組成部分[1-2]。根據其分子結構和抗原性的差異分為α、β、γ、ω 4種類型。α型干擾素根據結構的不同再分為α-1b、α-2a、α-2b，其中α-2b型干擾素是我國臨床上使用較多的一種。目前，干擾素由于其抗病毒作用強，抗病毒譜廣，在我國臨床上已廣泛應用于治療各種病毒感染所致的疾病，其中以治療病毒性肝炎的臨床應用最多、用量最大。在我國，各型病毒性肝炎均存在，尤其以乙型肝炎感染率最高、危害最大。目前，應用干擾素治療乙型肝炎非常重要。

臨床已批準使用的干擾素劑型主要有注射用凍干粉針、溶液型注射劑等普通劑型。由于干擾素如其他類細胞因子一樣，其體內、外穩定性差，進入體液后易被體內的酶系統破壞失活，體內生物半衰期短，同時，干擾素吸收后在體內分布于全身，缺乏靶向性，到達病灶部位的干擾素的量有限[3]。有報道，干擾素靜脈注射后，前1 h半衰期僅為15 min。其后3 h為90 min，6 h時血清中已檢測不到藥物水平。因此，臨床需大劑量、頻繁給藥，同時毒副作用、不良反應也隨之增大[4]。

脂質體是由類脂質雙分子組成的類似生物膜結構的封閉囊泡，是近年來研究較多的新型藥物載體。脂質體作為蛋白多肽類藥物的載體，具有提高藥物體內穩定性、延緩藥物釋放、延長生物半衰期、提高生物利用度的作用[5]。因此，研究開發重組人干擾素α-2b脂質體注射劑，利用脂質體載體的特點，以期達到延長藥物在體內的存留時間，提高肝靶向和療效的目的，具有重要意義。本文制備了重組人干擾素α-2b脂質體，以溶液作為參比，考察重組人干擾素α-2b脂質體家兔肌肉注射給藥體內藥動學的變化。

1 儀器與材料

DG-5031酶聯免疫檢測儀(南京華東電子集團醫療裝備有限公司)；TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠)；CSL120GXL超速離心機(日本 Hitachi koko co.,Ltd)；LS230 激光粒度分析儀(美國BECKMAN)。

重組人干擾素α-2b(北京斯諾爾生物技術有限公司提供)；人干擾素α定量酶聯檢測試劑盒(進口分裝，北京東方試劑公司)；Triton X-100 (FARCO CHEMICAL SUPPLIES HONG KONG)；大豆磷脂(SPC,Lipiod GmbH，Ludwigshafen Germany)；膽固醇(Cholesterol,Chol，廣州試劑公司，進口分裝)；其余試劑為分析純。

新西蘭種白兔,雄性，體重2.0～3.0 kg，由沈陽市東陵區龍元養殖場提供，合格證號：SCXK(遼)2003-0013號。

2 方法

2.1 重組人干擾素α-2b脂質體的制備及表征 稱取磷脂、膽固醇(摩爾比2∶1)組分溶解于乙醚中，用磷酸鹽緩沖液配制含一定濃度的rhIFN α-2b溶液作為水相，加入白蛋白作為穩定劑，水相與有機相以一定比例混合，冰浴超聲形成W/O乳劑，減壓除去有機溶劑，氮氣流繼續吹干使形成膠態狀，用磷酸鹽緩沖液40 ℃水化，超聲形成小單室脂質體,超濾后,過0.22 μm微孔濾膜，即得。采用超速離心法測定脂質體包封率。取干擾素脂質體樣品適量，以水為分散介質，用LS230激光粒度分析儀(Beckman Coulter)測定脂質體的粒度及其粒度分布。

2.2 重組人干擾素α-2b脂質體與溶液劑家兔肌肉注射給藥體內藥動學

2.2.1 血漿樣品處理方法 精密量取血漿樣品200 μL，加入含0.3% Triton X-100的試劑盒樣品稀釋液，稀釋至樣品濃度在測定標準曲線范圍內，采用 ELISA法測定藥物濃度。

2.2.2 雙抗體夾心ELISA法測定血漿重組人干擾素α-2b濃度 用抗人干擾素α (IFN-α)單抗體包被于酶標板上，每孔中加入標準品或待測樣品100 μL，標準品和樣品中的IFN-α與單抗體結合，加入酶標記的抗人IFN-α抗體，形成免疫復合物連接在板上，洗滌，去除過量結合物，再加入酶底物OPD，出現黃色，加入終止液硫酸，顏色變深，呈色與IFN-α抗體復合物結合物量成正比。在492 nm處測定的OD值與樣品或標準品中的IFN-α呈正比。用標準曲線法計算測定樣品濃度。

2.2.3 藥動學實驗方案 取家兔6只，隨機分成2組，每組3只，其中實驗組于左后腿部肌肉注射重組人干擾素α-2b脂質體(250萬IU/kg),對照組于左后腿部肌肉注射重組人干擾素α-2b溶液(250萬IU/kg),給藥后實驗組于0.8、1.2、2.17、3.33、4、6.25、8、12、24 h取血，對照組于0.5、1.4、2、3、4、6、8、12、24 h取血，置涂有肝素的離心管中，離心10 min(3 000 r/min),取出血漿，-80 ℃保存，待測。

2.3 數據處理 應用統計距法計算藥動學參數，并通過t檢驗進行顯著性分析。

3 結果

3.1 重組人干擾素α-2b脂質體的制備及表征 本文采用逆向蒸發法制備的重組人干擾素α-2b脂質體外觀為半透明溶液，其藥物包封率為84%，粒徑130 μm(SD 1.146)，90%的粒子小于156 μm。

3.2 藥動學研究 本文采用ELISA法測定血漿及組織中藥物濃度，經過特異性、回收率、精密度等含量分析方法學驗證，證明本法適用于家兔體內藥動學研究，確定線性范圍：32～2 000 pg/mL。

標準曲線方程：lgA=0.929 7 lgC-2.620 1，r2=0.980 6。

重組人干擾素α-2b脂質體及重組人干擾素α-2b溶液家兔肌肉注射體內血漿藥物濃度-時間圖見圖1，利用統計法求算藥動學參數，見表1。

結果表明，與溶液劑相比，重組人干擾素α-2b脂質體延緩了藥物的吸收，達峰時間Tmax由1.42 h延長至2.27 h，而峰濃度類似(14 283.7 pg/mL vs.15 000.0 pg/mL)，體內平均滯留時間(MRT)分別為4.86 h和6.00 h，脂質體組體內滯留時間較溶液劑組延長。體內消除半衰期分別為4.13 h和4.17 h(P<0.01)。血藥濃度曲線下面積(AUC0-∞)分別為73 902.7 pg/(mL·h)和103 323.3 pg/(mL·h)，脂質組AUC為溶液劑組的1.4倍，體內生物利用度顯著提高(P<0.05)。

圖1 家兔肌肉注射重組人干擾素α-2b脂質體及重組人干擾素α-2b溶液體內血漿藥物濃度-時間曲線圖

表1 家兔肌肉注射重組人干擾素α-2b脂質體及重組人干擾素α-2b溶液藥動學參數

注：與重組人干擾素α-2b溶液組比較，*P<0.05,**P<0.01

4 討論

已有文獻報道，逆相蒸發法適用于包裹水溶性大分子生物活性物質，通過該方法可以獲得藥物包封率較高的脂質體，但逆向蒸發法需要使用有機溶劑與含有藥物的水相性形成W/O，對于生物活性蛋白干擾素遇有機溶劑可能產生失活的問題。本文采用人血白蛋白作為活性穩定劑，其首先吸附在油水界面上，避免了藥物的界面吸附和失活，起到了良好的穩定作用。

目前，蛋白多肽類藥物的藥動學研究方法有同位素示蹤法、ELISA法和生物檢定法。ELISA法檢測藥物濃度，具有簡單、方便、快速、特異性強等優點，因此，本文采用ELISA法測定血漿及組織中藥物濃度，經過特異性、回收率、精密度等含量分析方法學驗證，證明本法適用于家兔體內藥動學研究，確定線性范圍：32～2 000 pg/mL。標準曲線方程：lgA=0.929 7 lgC-2.620 1，r2=0.980 6。

已有文獻報道了重組人干擾素α-2b脂質體肌肉注射小鼠或大鼠的藥動學過程，但家兔體內藥動學鮮有報道。本文制備了穩定重組人干擾素α-2b脂質體，并對其家兔體內藥動學進行了比較性研究，以期為重組人干擾素α-2b脂質體制劑的研究提供更加廣泛的動物體內數據。

結果表明，與參比制劑溶液劑相比，脂質體顯著改變了重組人干擾素α-2b家兔肌肉注射給藥的體內藥動學行為，使其吸收延長，達峰時間延長，體內平均滯留時間增加，AUC顯著提高。脂質體可作為重組人干擾素α-2b的潛在給藥系統。

參考文獻：

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[2] Lasfar A,Zloza A,Cohen-Solal KA.IFN-lambda therapy:current status and future perspectives [J] .Drug Discov Today,2016,21(1):167-171.

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[3] Garcia-Garcia I,Gonzalez-Delgado CA,Valenzuela-Silva C,et al.Bioequivalence of two recombinant interferon alpha-2b liquid formulations in healthy male volunteers [J] .Brugs R D,2004,5(5):271-280.

[4] 姚文兵，林碧蓉，沈子龍，等.聚乙二醇修飾干擾素α2b的體內藥代動力學研究[J] .中國藥科大學學報，2001，32(6)：457-461.

[5] Li H,Yang L,Cheng G,et al.Encapsulation,pharmacokinetics and tissue distribution of interferon α-2b liposomes after intramuscular injection to rats [J] .Arch Pharm Res,2011,34(6):941-948.