淫羊藿苷對前列腺癌原位移植瘤SCID小鼠脂肪酸合成酶和LNCaP細胞生物學行為的影響

饒 紅，武福云，何華瓊*

0 引言

前列腺癌(Prostatic cancer,CaP)是男性生殖系統最常見的惡性腫瘤[1]，好發于中老年男性，發病率及死亡率僅次于肺癌，嚴重危害男性生命健康[2]。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是從小檗科植物心葉淫羊藿和淫羊藿枝葉中提取的黃酮類生物堿，具有抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力及生殖能力等多種生物學活性，還可促進間充質干細胞增殖及遷移[3-4]。研究發現，其在Transwell小室遷移實驗中可通過干擾細胞周期而發揮抑制前列腺癌細胞株的生長、遷移和侵襲[5]。因其對活體前列腺癌原位移植瘤是否有相同的作用還鮮有研究，故本實驗首先通過原位接種建立嚴重聯合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)LNCaP前列腺癌原位移植瘤模型并在成模后用ICA進行干預性治療，以觀察ICA是否會影響到活體動物前列腺腫瘤組織中脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FAS)和LNCaP細胞生物學行為，為臨床可能用于治療CaP提供實驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SCID小鼠40只，雄性，6周齡，體重(20.0±0.5)g，購自湖北醫藥學院實驗動物中心，實驗室恒濕、恒溫，小鼠無菌隔離飼養器內單獨飼養，許可證號：[SYXK(鄂)2017-0031] 。

1.2 儀器和試劑 淫羊藿苷標準品購自北京索萊寶科技有限公司；乙醚購自廣州錢盛化工有限公司；人LNCaP前列腺癌細胞株、FAS ELISA試劑盒、FAS mRNA RT-PCR試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)、RPMI-1640細胞培養基和胎牛血清(FBS)均購于賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 瘤源復蘇和培養 先將凍存于液氮罐的人LNCaP前列腺癌細胞株冷凍管取出，37 ℃速融，倒入10 mL含體積分數為10% FBS的RPMI-1640培養液中，放入培養箱(5% CO2、37 ℃)復蘇24 h，然后更換以上培養液培養3 d，用0.25%的EDTA消化，注入離心管1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集底部LNCaP前列腺癌細胞株，再用RPMI-1640培養液將細胞數密度調制成2×107個/mL的細胞懸液備用。

1.3.2 SCID小鼠前列腺癌原位移植瘤模型建模方法 將SCID小鼠移入到超凈臺，用乙醚吸入麻醉后仰臥位固定，在下腹相當于髂前上棘處延腹白線正中切口，分離腹膜，顯露腹腔內膀胱，用醫用無菌棉簽將膀胱背側壁和頂壁向尾端翻轉，然后將生殖腺向兩側推開，找到膀胱頸處的葉狀前列腺(分左右2葉，顏色較周圍組織深)。用微量注射器抽取調制好的人LNCaP前列腺癌細胞株50 μL，左、右前列腺背外側葉包膜內各注射25 μL，注射后以葉包膜向上鼓起并輕微脫離前列腺腺體表面為滿意標準[6]。然后分層恢復臟器解剖位置后縫合，動物清醒后放回隔離器內。按上述步驟制作原位模型小鼠30只。動物術后單籠飼養，每天消毒1次，共3 d。要求動物房自然光照、恒溫恒濕(20～22 ℃，60%～70%)，小鼠自由飲純凈水，高壓滅菌飼料喂養。

1.3.3 實驗分組和治療 2周后，將上述30只建模SCID小鼠采用隨機數字表編號，隨機均分為前列腺癌組(CaP組)、淫羊藿苷高劑量組(80 mg/kg，高劑量組)和淫羊藿苷低劑量組(40 mg/kg，低劑量組)，每組10只，另取健康5周齡雄性SCID小鼠10只設為空白對照組(CON組)。高劑量組和低劑量組分別按80 mg/kg和40 mg/kg劑量共灌胃給藥干預性治療35 d。CaP組和CON組灌等量注射生理鹽水35 d。

1.4 指標檢測

1.4.1 LNCaP細胞腫瘤細胞生長和細胞周期檢測 治療35 d后脫臼處死小鼠，摘取雙側前列腺瘤體，分離背外側葉包膜，用吸濕綿吸干后稱重，并測量前列腺瘤體長、短徑，每個瘤體均測量3次，以其均值為準。瘤體積計算方法：瘤體積=A×B×B/2，其中A=腫瘤長徑，B=腫瘤短徑。抑瘤率=[CaP組平均瘤重-高劑量組(或低劑量組平均瘤重)] /CaP組平均瘤重×100%。瘤體積測量完成后分別編號，取部分前列腺瘤體制成組織勻漿液，流式細胞學(Flow cytometry，FCM)檢測LNCaP細胞周期，計算各周期比值。

1.4.2 FAS蛋白表達 取編號后保存的前列腺病理組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋，以厚度為4 μm連續切片，采用SP法檢測FAS陽性蛋白表達率。判定標準以染色后細胞質中見清晰黃至棕黃色為FAS陽性表達。

1.4.3 半定量RT-PCR檢測FAS mRNA 半定量RT-PCR檢測前列腺病理組織中FAS基因表達。用Pfimer5軟件設計PCR擴增引物序列(見表1)。采用RNA抽提試劑盒一步法提取總RNA，GAPDH為內參，PCR擴增并對目的基因的mRNA含量進行半定量分析。PCR反應條件為：95 ℃，2 min預變性，95、52、72 ℃各30 s，擴增35個循環。以目的基因灰度值/GAPDH灰度值之比值表示FAS基因的相對值(OD值)。

表1 引物序列表

2 結果

2.1 淫羊藿苷對FAS蛋白及基因表達的影響 CON組鼠前列腺病理組織中有少量FAS陽性蛋白及FAS mRNA表達。而CaP組FAS及FAS mRNA在前列腺廣泛表達，與CON組比較差異有統計學意義(F=67.014、79.296，P<0.05)。治療后，高劑量組和低劑量組均明顯降低，與CaP組比較差異有統計學意義(F=79.817、93.011，P<0.05)；但兩組組內比較差異無統計學意義(t=0.170、0.239，P>0.05)。見表2。

表2 淫羊藿苷對FAS蛋白及基因表達的影響(n=10)

注：與CON組比較，*P<0.05；與CaP組比較，#P<0.05

2.2 淫羊藿苷對腫瘤細胞生長的影響 治療后，與CaP組比較，高劑量組和低劑量組瘤重量、瘤體積均低于CaP組，抑瘤率高于CaP組，差異有統計學意義(F=76.394、103.471，P<0.05)；但兩組組內比較差異無統計學意義(t=0.094、0.193，P>0.05)。見表3。

表3 淫羊藿苷對腫瘤細胞生長的影響(n=10)

注：與CaP組比較，#P<0.05

2.3 淫羊藿苷對細胞周期的影響 FCM檢測顯示，CaP組G0/G1明顯高于CON組,而S期明顯低于CON組(F=91.257、112.653，P<0.05)。治療后，高劑量組和低劑量組前列腺癌LNCaP細胞阻滯于S期，其G0/G1比值明顯降低，S期明顯提高，與CaP組比較差異有統計學意義(F=47.269、97.304，P<0.05)；但兩組組內比較差異無統計學意義(t=0.412、0.107，P>0.05)。見表4。

表4 淫羊藿苷對細胞周期的影響(n=10)

注：與CON組比較，*P<0.05；與CaP組比較，#P<0.05

3 討論

FAS是內源性脂肪酸合成的關鍵酶，研究顯示，FAS在多種惡性腫瘤中表達增強，患者多出現脂肪酸代謝紊亂現象。目前，FAS已被證實在CaP腫瘤組織中高表達，因其驗出率及特異度高，目前已成為CaP的惡性程度、是否轉移及不良預后的重要參考指標[7]。目前,對CaP的治療以去勢、抗癌藥、化療為主，中醫中藥治療為輔，有研究表明，中藥可通過調節雄激素受體信號通路而達到治療目的[8-9]。淫羊藿是補益類中草藥，具有強筋祛濕補腎的作用，主治虛冷不育、陽痿遺精、腎虛喘咳、尿頻失禁、風濕痹痛、半身不遂、腰膝酸軟等病癥。現代藥理學研究發現，淫羊藿提取物ICA具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、調節機體免疫系統提高免疫力、抑制破骨細胞活性和促進成骨細胞生長等作用[10-11]。另外，淫羊藿苷還用于治療性功能障礙，在治療腫瘤時還具有抗細胞凋亡、增強腫瘤細胞對放化療的敏感性的作用[12-13]。

在本研究中，筆者預實驗顯示，LNCaP前列腺癌原位移植瘤模型SCID小鼠前列腺均有移植瘤生長，且腫瘤廣泛浸潤小鼠精囊、膀胱等周圍盆腔組織和臟器，形成固定的實質性團塊，說明造模成功。在正式實驗中，結果表明，ICA可降低FAS蛋白及其基因表達。FASE具有多種催化功能，是合成脂肪酸的功能酶，在惡性腫瘤組織中FASE異常高表達，高表達的FAS會催化內源性脂肪酸的大量合成，而內源性脂肪酸是腫瘤細胞生長必需的脂肪酸，因此，FASE高表達是腫瘤細胞為適應其惡性生長的需求[14]。筆者認為，ICA可通過抑制FAS合成，降低內源性脂肪酸的合成，間接降低腫瘤細胞生長所必需的脂肪酸供給，使生長速度減緩。現代醫學研究表明，惡性腫瘤的發生涉及多個基因和蛋白，如Rb、p21、p53、p16、BRCA1、p15等調控基因在腫瘤的發生過程中發生基因改變、失活，并由此造成細胞周期監測功能缺陷[14-15]。另外，惡性腫瘤生長的最基本生物學特征就是腫瘤細胞失控性增殖，即細胞周期調控紊亂，目前使用的抗癌藥主要作用于G2/M期和S期，可使失控性增殖的腫瘤細胞阻滯在G2/M期和S期[16]。研究表明，藥用植物及其提取物甾醇、單體等能夠誘導非正常細胞周期細胞發生細胞周期停滯現象，促使腫瘤細胞脫噬而發揮抗癌作用[17]。從本實驗結果來看，高劑量組和低劑量組S期細胞比值升高、G0/G1期細胞比例降低，與CaP組比較差異有統計學意義，說明ICA可將接種的LNCaP 前列腺癌細胞阻滯在S期。另外，高劑量組和低劑量組瘤體積和瘤重量明顯低于CaP組，FCM檢測顯示抑瘤率分別為39.47%和37.28%，表明ICA對前列腺癌細胞的生長具有明顯的抑制作用。

總之，本研究表明，ICA可明顯抑制前列腺癌原位移植瘤的生長，推測淫羊藿苷可能通過抑制FAS來降低腫瘤細胞生長必需的內源性脂肪酸的合成，并使失控性增殖的腫瘤細胞阻滯在S期，調節LNCaP細胞生物學行為，明顯抑制其生長、遷移與侵襲能力，誘導腫瘤細胞凋亡和生長抑制，為ICA開發后可能應用于臨床治療CaP提供了理論參考。

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