11β-HSD1抑制劑對大鼠股骨頭壞死微環境及骨重建影響的實驗研究

何 寧，曾 云，王志勇，韓 珩，唐 冰，熊 敏

0 引言

骨代謝過程中起決定作用的細胞是成骨細胞及破骨細胞，可促進骨形成和骨吸收，糖皮質激素在維持骨吸收、骨形成的平衡以及在促進骨代謝、骨骼生長等方面發揮了必不可少的作用[1-3]。然而，目前，隨著糖皮質激素類藥物的廣泛使用，由激素所引發的股骨頭壞死比較常見，后者可引起骨組織產生一系列的病理性變化，影響骨功能[4]。內源糖皮質激素的關鍵代謝酶是11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase，11β-HSD1)，也是糖皮質激素在組織水平上的前受體調節劑，可以催化C11 位的酮基轉化為羥基，使皮質醇向11-脫皮質酮轉化，生物學活性喪失[5-7]。有研究表明，在特殊狀態下，局部11β-HSD1可能改變，引起糖皮質激素水平變化，骨代謝穩態受到影響[8-11]。本文探討了11β-HSD1抑制劑對大鼠股骨頭壞死微環境及骨重建的影響，分析11β-HSD1的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供的清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體重(200±20) g，合格證號：SYXK2103-0003。懸吊動物飼養飲水瓶，使動物飲水時，下肢保持直立，喂養采用普通飼料。鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)購自武漢博士德公司；醋酸皮質酮購自Sigma公司；一抗11β-HSD1購自武漢博士德公司。

1.2 動物處理 采用抽簽法隨機分組，清潔級SD大鼠40只分為空白組10只和模型組30只，每次實驗均精確稱重，模型組建立激素誘導股骨頭壞死模型。本研究參照文獻[4]的造模法，模型組建立激素誘導股骨頭壞死模型，于腹腔注射青霉素鈉(14萬U/只)和醋酸潑尼松龍(24.5 mg/kg)，2次/周，連續使用4周。空白組用生理鹽水代替激素，于腹腔內注射等劑量的青霉素和生理鹽水。模型組造模成功后分為對照組與實驗組，各15只，對照組不進行處理，實驗組選擇腹腔內注射11β-HSD1抑制劑(8 g/kg)，2次/周，處理4周。

1.3 觀察指標 ①11β-HSD1檢測：頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下摘取其雙側股骨頭，制作標本，進行石蠟切片，采用兔抗大鼠多克隆一抗11β-HSD1，測定11β-HSD1在股骨頭內的表達，選擇β-actin作為內標，4 ℃冰箱孵育12 h，采用免疫印跡法。②TGF-β1檢測：抽取實驗大鼠的腹部靜脈血，4 ℃ 2 000 r/min離心15 min，取上層血清，采用酶聯免疫法測定血清TGF-β1含量。③SOD與MDA檢測：實驗后將10%水合氯醛350 mg/kg注射于腹腔，將大鼠頸椎脫臼法處死后，進行SOD與MDA的檢測，檢測區域為腦組織海馬區。

2 結果

2.1 11β-HSD1表達情況對比 模型組的11β-HSD1相對表達量明顯高于空白組(P<0.05)，實驗組的11β-HSD1相對表達量低于對照組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 不同大鼠的11β-HSD1表達情況比較

2.2 血清TGF-β1含量對比 模型組的血清 TGF-β1含量為(51.44±6.39) pg/mL，空白組為(29.44±4.29) pg/mL，試驗組為(48.29±5.11) pg/mL，對照組為(59.22±5.11) pg/mL，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠11β-HSD1表達情況對比

表2 不同大鼠的血清 TGF-β1含量表達情況比較

2.3 SOD與MDA含量對比 與空白組相比，模型組SOD含量減少(P<0.05)，MDA顯著增加(P<0.05)；實驗組的SOD與MDA含量與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同大鼠的腦組織SOD、MDA含量比較

3 討論

骨重建過程是一個新骨替換舊骨的過程，伴隨著骨吸收與骨形成過程相偶聯。骨形成過程中，成骨細胞在骨基質的礦化、合成及分泌中起主要作用，為主要的功能細胞[12]；對糖皮質激素較為敏感[13]，正常劑量下功能維持，高劑量下不耐受，會引發骨小梁密度減少等情況的發生，延緩骨重建進程，誘導股骨頭壞死的發生[14]。股骨頭微環境內存在多種細胞成分，包括成骨細胞、骨髓間質細胞、脂肪細胞等。

現代研究表明，骨組織內的11β-HSD1與糖皮質激素所引發的骨代謝異常緊密相關。11β-HSD1屬于短肽鏈乙醇氧化還原酶家族，定位于1號染色體上，含有2個糖基化位點，6個外顯子。糖基化抑制劑對11β-HSD1的脫氫酶起到抑制作用[15]。有研究發現，地塞米松誘導人前成骨細胞株，11β-HSD1的活動隨地塞米松劑量加大而逐漸下降，在IL-1β、TNF-α等炎癥因子協同下，可導致11β-HSD1的表達增多，骨代謝異常及股骨頭壞死發生的可能性增加[16]；細胞堿性磷酸酶的礦化活動隨地塞米松劑量加大而逐漸增多，具有平臺期[17]。本研究顯示，模型組的11β-HSD1相對表達量明顯高于空白組，實驗組的11β-HSD1相對表達量低于于對照組。也有研究顯示，健康男性的外周血骨鈣蛋白、N-末端Ⅰ型膠原前肽等骨形成標志物，在攝入過量的潑尼松后出現下降趨勢，下降程度與體內11β-HSD1活動相關[18]。骨重建過程與成骨細胞分化的功能狀態、不同的階段、細胞數量等具有相關性。

11β-HSD1在成骨與脂肪細胞均有中等量表達，能影響細胞局部內源性糖皮質激素的二次激活。而在股骨頭微環境中，隨著成骨及脂肪細胞外部內源性糖皮質激素水平的下降，11β-HSD1的表達反而增強[19]。有報道，當糖皮質激素過量，11β-HSD1與糖皮質激素的關系呈現正相關，延長皮質醇的活性半衰期，增強激素對組織或成骨細胞的效應，影響微環境內骨小梁發育及生理狀態[20]。TGF-β1在血小板和骨組織中含量豐富，是一種具有多種功能的多肽，可以促血管生長，與各類軟組織的損傷修復相關，起促進作用。TGF-β1在骨與軟骨的形成、炎癥反應以及組織修復過程中也起到重要作用。本研究顯示，11β-HSD1抑制劑對11β-HSD1表達的調節，有利于激素性股骨頭缺血壞死大鼠股骨頭的重建。也有研究表明，隨著人類年齡增長，IGF-1β等生長因子含量減少，而11β-HSD1在骨組織中的表達增加，導致骨組織含水量減少，骨的彈性減弱，抗壓能力降低[21]。

正常機體氧自由基產生與清除處于動態平衡，但是由于多因素的影響，機體氧自由基平衡失調，生成增加，而清除減少，過多的活性氧對DNA、酶類以及生物膜類等產生破壞作用，引發細胞死亡，損傷腦組織，產生破壞作用[22]。脂質過氧化的主要終產物是MDA，機體內MDA水平可間接反映脂質過氧化的程度以及氧自由基水平。SOD經歧化反應，使氧自由基減少，從而使細胞損害減少。本研究結果顯示，與空白組相比，模型組SOD含量減少，MDA含量顯著增加；實驗組的SOD與MDA含量與對照組相比差異有統計學意義，表明11β-HSD1抑制劑清理自由基和抗氧化作用更強。有研究表明，11β-HSD1轉基因小鼠經激素處理后，其成骨細胞、骨形成率、骨質面積與經激素處理的普通實驗大鼠相比，明顯增高，說明早期前分化細胞的排列及成熟過程受11β-HSD1影響，表達過多會出現一定的干擾[23]。

總之，11β-HSD1抑制劑能夠改善大鼠股骨頭壞死的微環境，抑制TGF-β1的表達，增強成骨作用，有利于骨重建。

參考文獻：

[1] Cheleschi S,Cantarini L,Pascarelli NA,et al.Possible chondroprotective effect of canakinumab:an in vitro study on human osteoarthritic chondrocytes[J].Cytokine,2015,71(2):165-172.

[2] Wang J,Kalhor A,Lu S,et al.iNOS expression and osteocyte apoptosis in idiopathic,non-traumatic osteonecrosis[J].Acta Orthop,2015,86(1):134-141.

[3] 綦雯雯,賈凱英,孫達,等.吡格列酮對糖尿病大鼠中樞神經系統11β-羥類固醇脫氫酶1型表達的影響[J].神經疾病與精神衛生,2017,17(3):184-186.

[4] Wang L,Luo DK,Pan ZY.Expression of 11β-HSD in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head[J].Mol Med Rep,2013,7(5):1482-1486.

[5] 余相地,曹紅.姜黃素對神經病理性疼痛大鼠脊髓11β羥基固醇脫氫酶1表達的影響[J].國際藥學研究雜志,2017,44(6):551-555,560.

[6] Gagala J,Buraczynska M,Mazurkiewicz T,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene intron 4 polymorphism in non-traumatic osteonecrosis of the femoral head[J].Int Orthop,2013,37(7):1381-1385.

[7] Sekkat J,Rachidi O,Janani S,et al.Idiopathic avascular necrosis of the femoral heads in five members of a moroccan family[J].Joint Bone Spine,2012,79(5):504-506.

[8] 辛婧,葉磊,楊可,等.小鼠11β-HSD1基因真核表達載體的構建及應用[J].中國現代醫學雜志,2017,27(16):12-17.

[9] 何豐,葉進.皮質醇和11βHSD mRNA 在 OSAHS 中表達的研究[J].新醫學,2016,47(9):609-613.

[10]Okazaki S,Nagoya S,Matsumoto H,et al.TLR4 stimulation and corticosteroid interactively induce osteonecrosis of the femoral head in rat[J].J Orthop Res,2016,34(2):342-345.

[11]Mikobi TM,Lukusa TP,Aloni MN,et al.Correlation between the lactate dehydrogenase levels with laboratory variables in the clinical severity of sickle cell anemia in congolese patients[J].PLoS One,2015,10(5):e0123568.

[12]徐杰,李國平,唐蔚青,等.部分炎癥因子活化11β-HSD1參與非酒精性脂肪肝發生的研究進展[J].心肺血管病雜志,2016,35(4):330-333.

[13]Zheng L,Wang W,Ni J,et al.The association of eNOS gene polymorphism with avascular necrosis of femoral head[J].PLoS One,2014,9(2):e87583.

[14]Gagala J,Buraczynska M,Mazurkiewicz T,et al.Prevalence of genetic risk factors related with thrombophilia and hypofibrinolysis in patients with osteonecrosis of the femoral head in Poland[J].BMC Musculoskelet Disord,2013,14:264.

[15]Kim HS,Bae SC,Kim TH,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and the risk of osteonecrosis of the femoral head in systemic lupus erythematosus[J].Int Orthop,2013,37(11):2289-2296.

[16]吳國瓊,林梅,郭菲菲,等.11β-羥基類固醇脫氫酶1型抑制劑對高脂血癥大鼠肝臟、脂肪和骨骼肌脂代謝基因的影響[J].中國老年學雜志,2016,36(22):5527-5529.

[17]Li X,Li YS,Li LJ,et al.Overactivated autophagy contributes to steroid-induced avascular necrosis of the femoral head[J].Exp Ther Med,2017,14(1):367-372.

[18]Jajosky RP,Lumm WC,Wise SC,et al.A suspected delayed hemolytic transfusion reaction mediated by anti-Joa[J].Immunohematology,2017,33(2):73-75.

[19]趙佳,魏波,劉軍,等.皮質酮對大鼠股骨頭微環境11β-H SD1表達及骨重建影響的初步實驗研究[J].重慶醫學,2016,43(3):336-338.

[20]Wang Y,Li X,Gao Y,et al.Genetic polymorphisms of CYP3A4 among Chinese patients with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J].Medicine (Baltimore),2016,95(44):e5332.

[21]Zhou ZC,Gu SZ,Wu J,et al.VEGF,eNOS,and ABCB1 genetic polymorphisms may increase the risk of osteonecrosis of the femoral head[J].Genet Mol Res,2015,14(4):13688-13698.

[22]孫紅爽,乜春城,朱小麗,等.11β-HSD1在糖皮質激素聯合高脂喂養大鼠胰島素抵抗中的作用[J].國際內分泌代謝雜志,2016,36(1):14-19.

[23]Ikemura S,Yamamoto T,Motomura G,et al.Cytochrome P4503A activity affects the gender difference in the development of steroid-induced osteonecrosis in rabbits[J].Int J Exp Pathol,2014,95(2):147-152.