大蒜素對(duì)慢性腎衰大鼠腎臟組織纖維化抑制作用的研究

郭洋洋

0 引言

慢性腎功能衰竭(Chronic renal failure,CRF)是多種慢性腎臟疾病導(dǎo)致腎功能減退，引發(fā)腎小球?yàn)V過率下降、毒素潴留、電解質(zhì)代謝紊亂、酸堿失衡等，呈現(xiàn)全身多系統(tǒng)癥狀的臨床綜合征[1-2]，是各種腎臟疾病終末期的共同結(jié)局。既往研究發(fā)現(xiàn)，腎臟組織纖維化是導(dǎo)致腎結(jié)構(gòu)破壞、功能減退甚至喪失的主要病理原因，是各種慢性腎病發(fā)展為慢性腎衰的共同通路[3]，因此，抑制腎纖維化是延緩腎衰的有效途徑，也是新藥研發(fā)的重要思路。大蒜素是一種具有降血脂、改善血流動(dòng)力學(xué)等藥理學(xué)作用的二烯丙基三硫化物[4-5]。葉靜等[6]和曾玉蘭等[7]研究顯示，大蒜素對(duì)肝組織纖維化和肺組織纖維化均具有一定的抑制作用，但大蒜素對(duì)腎臟組織纖維化的影響相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究通過制備CRF大鼠模型，觀察大蒜素對(duì)CRF大鼠腎臟組織纖維化的影響，探討大蒜素對(duì)CRF大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，7周齡，體重200～240 g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(冀)：2013-1-003]。

1.2 試驗(yàn)藥物與試劑 大蒜素注射液(黑龍江江世藥業(yè)有限公司，2 mL∶30 mg)；H&E試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；BUN、SCr、UA、Pro試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；C-Ⅳ、PC-Ⅲ、LN、HN、CRP、IL-6、TNF-α試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)；ColⅠ、PAI-1、MMP-1多克隆抗體SP試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；腺嘌呤(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 模型制備與分組 參照杜卉蓮等[8]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備CRF大鼠模型：25%腺嘌呤溶液250 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃21 d制備CRF大鼠模型，正常對(duì)照組正常飲食水。80只模型大鼠隨機(jī)分為模型組和大蒜素低[5 mg/(kg·d)]、中[10 mg/(kg·d)]、高[20 mg/(kg·d)]劑量組，每組20只，另設(shè)正常對(duì)照組(20只)。取大蒜素注射液并加適量生理鹽水配制濃度為10、5、2.5 mg/mL的大蒜素溶液，各組大鼠分別給藥(2 mL/kg)，模型組和正常對(duì)照組分別給予等體積生理鹽水(2 mL/kg)。療程為28 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血清指標(biāo)檢測(cè) 腹腔注射10%水合氯醛實(shí)施麻醉，開腹并經(jīng)腹主動(dòng)脈取血(不抗凝)，離心取血清，分別按照試劑盒使用說明進(jìn)行處理，然后通過生化分析儀測(cè)定血清BUN、SCr、UA、Pro含量；參照各指標(biāo)ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)血漿中C-Ⅳ、PC-Ⅲ、LN、HN水平；參照各指標(biāo)ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中CRP、IL-6、TNF-α含量水平。

1.4.2 腎臟指數(shù)計(jì)算 治療完成后，分別稱鼠體重，取雙側(cè)腎臟組織并稱重左側(cè)腎重量，然后計(jì)算腎臟指數(shù)，腎臟指數(shù)=左側(cè)腎臟重量/體重。

1.4.3 腎臟組織病變觀察及病變?cè)u(píng)分 取右側(cè)腎臟組織，置于多聚甲醛溶液(濃度為4%)中固定72 h，依次進(jìn)行石蠟包埋、切片(3 μm)和常規(guī)脫蠟水化處理，按照HE染色試劑盒說明進(jìn)行處理，封片后通過顯微鏡觀察腎臟組織病變并照相保存。參照鐘瑜萍等[5]報(bào)道的方法進(jìn)行腎臟組織病變?cè)u(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，病變積分=∑各部位病變?cè)u(píng)分。

1.4.4 腎臟中ColⅠ、PAI-1、MMP-1表達(dá)的測(cè)定 取“1.4.3”項(xiàng)制備的腎臟組織石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化處理后，采用SP法行免疫組織化學(xué)染色觀察Col Ⅰ、PAI-1、MMP-1表達(dá)。采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)分析染色結(jié)果，分別選取5個(gè)不同視野測(cè)定光密度值(OD)，以O(shè)D表示Col Ⅰ、PAI-1、MMP-1表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 血清腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 CRF模型組大鼠血清BUN、SCr、UA、Pro含量均升高(P<0.01)；大蒜素中、高劑量組上述指標(biāo)與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.2 腎臟指數(shù) CRF模型組大鼠體重降低，且腎臟指數(shù)升高(P<0.01)；大蒜素中、高劑量組CRF大鼠體重大于模型組(P<0.05)，且腎臟指數(shù)較低(P<0.01)。見表3。

表1 腎臟組織病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 各組大鼠腎功能指標(biāo)結(jié)果比較

表3 各組大鼠腎臟指數(shù)比較

2.3 腎臟組織病變觀察結(jié)果及病變?cè)u(píng)分測(cè)定結(jié)果 通過HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠腎小球、腎小管、間質(zhì)區(qū)組織均未見異常，未見炎癥病變；CRF模型組呈現(xiàn)腎小球增大變性，球囊黏連，囊腔和管腔擴(kuò)大，腎小管內(nèi)結(jié)晶、壞死，可見大量炎癥細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；大蒜素低、中、高劑量組CRF大鼠腎臟組織病變得到不同程度的改善，以高劑量組最為顯著。CRF模型組大鼠腎臟組織病變?cè)u(píng)分顯著升高(P<0.01)；大蒜素中、高劑量組CRF大鼠病變?cè)u(píng)分低于模型組(P<0.01)，見表4。

表4 各組大鼠病變?cè)u(píng)分比較

2.4 血清中C-Ⅳ、PC-Ⅲ、LN、FN水平測(cè)定結(jié)果 CRF模型組大鼠血清中C-Ⅳ、PC-Ⅲ、LN水平升高，F(xiàn)N水平降低(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組CRF大鼠血清C-Ⅳ、PC-Ⅲ水平降低(P<0.05或P<0.01)，F(xiàn)N水平提高(P<0.05或P<0.01)，高劑量組LN水平低于中劑量組(P<0.05)。見表5。

2.5 血清中炎癥因子含量測(cè)定結(jié)果 CRF模型組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組CRF大鼠血清CRP、TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01)，其中高劑量組IL-6含量低于中劑量組。見表6。

2.6 腎臟組織中ColⅠ、PAI-1、MMP-1表達(dá)測(cè)定結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色顯示，CRF模型組大鼠腎臟組織ColⅠ、PAI-1表達(dá)顯著上調(diào)，而MMP-1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組ColⅠ、PAI-1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，MMP-1表達(dá)上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。見表7。

3 討論

CRF發(fā)病率高達(dá)568/1 000 000，占據(jù)主要死亡原因的第5～9位[9]，是醫(yī)藥學(xué)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。高濃度腺嘌呤攝入法制備的CRF動(dòng)物模型病理變化與人CRF接近，是目前研究CRF常用的動(dòng)物模型制作方法[10-11]。本實(shí)驗(yàn)通過腺嘌呤溶液250 mg/(kg·d)灌胃21 d的方法建立CRF動(dòng)物模型，研究顯示，大蒜素治療28 d，能夠有效降低CRF大鼠BUN、SCr、UA、Pro含量，抑制CRF大鼠腎臟組織病變，提高體重并降低腎臟指數(shù)，提示大蒜素可以改善CRF大鼠腎功能，對(duì)其腎臟組織具有一定的保護(hù)作用。

腎臟組織纖維化是各種腎臟慢性疾病逐漸發(fā)展為CRF的共同病理通路，因此,阻滯其纖維化是延緩CRF的必要途徑。ColⅠ是腎組織間質(zhì)中存在的主要膠原成分，ColⅠ過度積聚是腎組織纖維化的重要原因[12]。正常生理狀態(tài)下，ColⅠ生成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡，基質(zhì)金屬蛋白酶系(MMPs)和絲氨酸蛋白酶系(PAIs)是機(jī)體ColⅠ表達(dá)的主要調(diào)控酶。MMPs系統(tǒng)中，MMP-1和PAIs系統(tǒng)中的PAI-1對(duì)ColⅠ及腎臟組織細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix，ECM)的合成與降解起主要調(diào)控作用[13-14]。其中PAI-1具有抑制纖溶酶原激活物活化而抑制MMP-1活性的作用，因此，在MMP-1、PAI-1構(gòu)成的ColⅠ降解調(diào)控系統(tǒng)中，MMP-1是降解ColⅠ的主要調(diào)控酶，而PAI-1主要通過調(diào)節(jié)MMP-1活性而間接調(diào)控ColⅠ的降解[12]。C-Ⅳ、LN、FN是構(gòu)成ECM的主要成分，Border等[15]研究發(fā)現(xiàn)，血清C-Ⅳ、LN含量升高及FN降低是慢性腎衰病變的重要臨床指征。PC-Ⅲ是一種間質(zhì)膠原，廣泛存在腎組織中，其聚集升高是促進(jìn)腎臟組織纖維化和腎小球硬化的重要原因。本研究結(jié)果顯示，大蒜素治療28 d，能夠有效降低CRF大鼠血清C-Ⅳ、LN、PC-Ⅲ含量，并提高FN含量；免疫組織化學(xué)染色(IHC)顯示，大蒜素治療28 d，能夠有效下調(diào)CRF大鼠腎臟組織ColⅠ蛋白表達(dá)并下調(diào)PAI-1表達(dá)、上調(diào)MMP-1表達(dá)，提示大蒜素調(diào)節(jié)MMPs、PAIs調(diào)控系統(tǒng)，并調(diào)節(jié)血清C-Ⅳ、LN、PC-Ⅲ、FN含量，具有抑制CRF大鼠腎臟組織纖維化的作用。

表5 各組大鼠C-Ⅳ、PC-Ⅲ、LN、FN水平比較

表6 各組大鼠血清炎癥因子含量比較(n=20)

表7 各組大鼠ColⅠ、PAI-1、MMP-1表達(dá)比較

腎臟組織纖維化病理機(jī)制復(fù)雜，楊婧等[16]研究顯示，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在腎臟組織纖維化病變過程中發(fā)揮著重要作用。血清炎癥細(xì)胞因子(CRP、IL-6、TNF-α)含量水平是臨床監(jiān)測(cè)機(jī)體炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素治療28 d，能夠有效降低CRF大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量水平，進(jìn)而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，大蒜素可能通過抑制腎臟組織纖維化而對(duì)CRF大鼠起到一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與大蒜素調(diào)節(jié)MMPs、PAIs調(diào)控系統(tǒng)并調(diào)節(jié)血清C-Ⅳ、LN、PC-Ⅲ、FN含量，以及抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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