視黃醇對試驗性乳腺炎大鼠氧化應激的調節機制

盧勁曄， 顧蓓蓓， 馮 晴， 馬 卉， 盧 煒， 劉 靜

(1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300； 2.泰州出入境檢驗檢疫局，江蘇泰州 225300； 3.江蘇省東海縣動物衛生監督所，江蘇東海 222002)

乳腺炎是由多種非特異性的病原微生物引起的，目前臨床上分離的乳腺炎致病菌超過137種，大腸桿菌是臨床型乳腺炎中最常見的類型[1]。病原菌入侵宿主是一個復雜的動態的多因子作用過程。中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophilic leukocytes，PMN)是乳腺抵御病原菌入侵重要的防御細胞，PMN的活化在炎癥的發生、發展及轉歸過程中發揮了重要的作用。研究證實PMN通過釋放活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)殺滅病原微生物[2-3]。ROS的產生對清除胞內微生物是必需的，但持續過度激活，超過局部抗氧化劑的防御反應時，會引起乳腺上皮細胞的死亡、脫落[4-5]。

維生素A是含有β-白芷酮環的不飽和脂肪醇，是動物及人類維持正常生命活動所必需的脂溶性維生素，視黃醇、視黃醛和視黃酸是維生素A的3種衍生物，通常所說的維生素A即視黃醇。研究表明，視黃醇對維持上皮細胞的完整性，促進動物生長，維持正常的視覺，維持骨骼正常的生長代謝都是必不可少的。近年來，研究發現，視黃醇能提高機體免疫功能，增強機體抗感染能力[6-7]。本試驗將研究視黃醇對大腸桿菌誘發的試驗性乳腺炎大鼠氧化應激的調節作用，為奶牛乳腺的健康調控提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 細菌

乳腺炎致病菌大腸桿菌(Escherichialcoli)由南京農業大學動物醫學院泌乳生化教研室提供。大腸桿菌經肉湯培養基復壯后在普通營養瓊脂平板分離成單個菌落，試驗前挑取單個菌落于肉湯培養基中37 ℃培養24 h，無菌取100 μL均勻涂抹在瓊脂糖平板上，37 ℃培養24 h后刮取菌苔，溶解于滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，3 000 r/min離心10 min，連續3次，用平板稀釋計數法調整濃度至2×1012CFU/mL。

1.2 動物與試驗設計

60只清潔級SD大鼠，自懷孕10 d起，每天灌胃 8 000 IU/(kg·d)視黃醇(溶解于大豆油)，對照組灌胃等體積大豆油直至分娩。產后72 h經乳頭管注入2×1012CFU/mL 大腸桿菌懸液每側100 μL到第4對乳腺(兩側)內，分別于灌注前(定義為0 h)及灌注后12、24、48、72 h(n=6)頸靜脈放血處死動物，收集血清、肝素抗凝血及乳腺組織用于后續分析。

1.3 主要試劑及儀器

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；TRIzol購自Invitrogen公司；RNA酶抑制劑、隨機引物、M-MLV、dNTPs購自Promega公司；SYBR? Green PCR Master Mix購自Toyobo公司；乙酸肉豆蔻佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、雙氫羅丹明(dihydrorhodamin，DHR 123)購自Sigma公司。

UV755B型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；光學顯微鏡，日本奧林巴斯BH2；組織勻漿器，瑞士Kinematica AG；核酸濃度測定儀，德國Eppendorf Biophotometer；熒光定量PCR儀，ABI Prism 7300；流式細胞儀，美國BD Biosciences。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 熒光定量PCR檢測乳腺組織細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)mRNA表達 TRIzol試劑盒提取乳腺組織總RNA，用隨機引物同時對所有樣品進行反轉錄，建立各樣品的cDNA。PCR反應條件為： 95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45個循環。數據分析采用2-ΔΔCT法。ICAM-1及β-actin基因引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物參數

1.4.2 血清與乳腺組織中MPO的測定 按試劑盒說明書操作。

1.4.3 流式細胞術測定外周血PMN活性氧釋放 100 μL全血加入終濃度為100 ng/mL PMA刺激PMN，同時設無PMA刺激對照(等量PBS代替PMA)；37 ℃ 15 min后加入DHR123工作液，終濃度為5 μmol/L，37 ℃孵育10 min；裂解紅細胞，0.01 mol/L、pH值7.2 PBS洗滌2次并重懸于PBS中，混勻后流式細胞儀檢測。

1.5 數據處理

用SPSS 17.0方差分析程序對試驗數據進行統計分析，統計結果以平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 乳腺組織ICAM-1 mRNA相對表達的變化

誘發試驗性乳腺炎后乳腺組織ICAM-1 mRNA相對表達各個時間點均顯著升高，72 h時表達有下降趨勢，但仍顯著高于0 h。對照組ICAM-1相對表達峰值出現在24 h時，試驗組ICAM-1相對表達峰值前提，出現在12 h時，且峰值較對照組高，48、72 h時相對表達仍高于0 h，但與同時間點的對照組相比已有所下降(圖1)。

2.2 血清與乳腺組織中MPO活性的變化

誘導乳腺炎后12 h，對照組血清中MPO活性顯著升高，試驗組與同時間點對照組相比MPO活性顯著降低(圖2-A)。乳腺組織中MPO活性12、24 h與0 h差異顯著，峰值出現在24 h，至72 h時基本恢復至正常水平。與同時間點比較，試驗組MPO活性均低于對照組，且12、24 h差異顯著(圖2-B)。

2.3 外周血中性粒細胞活性氧釋放的動態變化

從圖3可以看出，灌注大腸桿菌懸液后各個時間點外周血PMN活性氧釋放與0 h比較均顯著升高，峰值出現在 24 h。與對照組相比，視黃醇處理能顯著刺激誘導后12 h PMN活性氧的釋放，隨后各個時間點試驗組ROS釋放均顯著低于同時間點的對照組。

3 討論與結論

作為機體最大的外分泌腺，乳腺在進化、發育和泌乳再構建的過程中時刻面臨著病原微生物的侵襲。病原菌入侵乳腺組織是一個復雜動態的多因子作用過程，然而目前宿主對抗乳腺感染的作用機制研究尚不深入，這是乳腺炎得不到有效控制的原因之一。

PMN是機體抵抗感染的主要非特異性防御細胞，病原菌入侵乳腺組織后大量循環血液中的PMN向乳腺組織遷徙，是乳腺炎發生時的重要特征。細菌入侵后通過激活NF-κB/AP-1刺激單核、巨噬細胞產生多種趨化因子促進PMN的趨化[8-9]。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族的成員，廣泛表達于各種細胞表面，在細胞間的相互作用以及白細胞黏附聚集中起著重要作用[10]。本研究顯示，在大腸桿菌誘發的大鼠試驗性乳腺炎模型中，乳腺組織中ICAM-1 mRNA表達顯著升高，但是與對照組相比，視黃醇能提前啟動ICAM-1的高表達，促進PMN迅速遷徙至炎癥部位發揮吞噬活性。

MPO是PMN的標志酶，MPO活性的高低反映了PMN在組織中的潴留和活化程度。灌注大腸桿菌懸液后乳腺組織中MPO活性迅速上升，視黃醇處理能顯著下調MPO活性，表明視黃醇能緩解PMN在乳腺組織持續過度激活引起的組織損傷。PMN進入宿主乳腺組織，主要是通過釋放ROS吞噬病原微生物，ROS是宿主抵御感染的主要效應分子，但是ROS的產生在殺滅病原微生物的同時，對宿主細胞和吞噬細胞本身也會造成損傷[4-5]。ROS的結果與MPO活性變化規律一致，大腸桿菌灌注乳腺后各個時間點ROS均顯著升高，視黃醇能提前刺激PMN釋放ROS發揮吞噬活性，減輕PMN持續激活引起的組織損傷。

大量循環血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙是乳腺炎發生時的重要特征。PMN通過釋放活性氧消滅病原微生物，但高毒性的活性氧也會引起乳腺組織的損傷。研究表明，視黃醇處理能促使機體迅速啟動免疫反應，促進PMN等效應細胞第一時間遷徙至乳腺組織發揮吞噬效應，同時大量被激活的PMN能迅速從乳腺腺泡清除促進了乳腺炎癥的轉歸。研究結果為臨床上乳腺炎的免疫調控及防治提供了理論基礎。

參考文獻：

[1]Gu B B，Miao J F，Yanmei F，et al. Retinoic acid attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses by suppressing TLR4/NF-kappaB expression in rat mammary tissue[J]. International Immunopharmacology，2010，10(7)：799-805.

[2]West A P，Shadel G S，Ghosh S. Mitochondria in innate immune responses[J]. Nature Reviews Immunology，2011，11(6)：389-402.

[3]Arnoult D，Carneiro L，Tattoli I，et al. The role of mitochondria in cellular defense against microbial infection[J]. Seminars in Immunology，2009，21(4)：223-232.

[4]Lauzon K，Zhao X，Bouetard A，et al. Antioxidants to prevent bovine neutrophil-induced mammary epithelial cell damage[J]. Journal of Dairy Science，2005，88(12)：4295-4303.

[5]Zhao X，Lacasse P. Mammary tissue damage during bovine mastitis：causes and control[J]. Journal of Animal Science，2008，86(13)：57-65.

[6]Ramadan A A，Ghoniem A A，Hassan H M，et al. Effects of beta-carotene，selenium and vitamin A oninvitropolymorphonuclear leukocytic activity in peripartal buffalo (Bubalusbubalus)[J]. Theriogenology，2001，55(3)：693-704.

[7]Datta P K，Lianos E A. Retinoic acids inhibit inducible nitric oxide synthase expression in mesangial cells[J]. Kidney International，1999，56(2)：486-493.

[8]Naeem A，Zhong K，Moisá S J，et al. Bioinformatics analysis of microRNA and putative target genes in bovine mammary tissue infected withStreptococcusuberis[J]. Journal of Dairy Science，2012，95(11)：6397-6408.

[9]Fu Y，Gao R，Gao Y，et al. Curcumin attenuates inflammatory responses by suppressing TLR4-mediated NF-κB signaling pathway in lipopolysaccharide-induced mastitis in mice[J]. International Immunopharmacology，2014，20(1)：54-58.

[10]Teixeira A S，Araújo F A，Ferreira M A，et al. Angiogenesis and inflammation in skeletal muscle in response to ascites tumor in mice[J]. Life Sciences，2006，78(14)：1637-1645.