菌根真菌提高紫蘇根腐病抗性的機制研究

劉芳潔

(晉中職業技術學院，山西晉中 030600)

紫蘇(PerillafrutescensL.)，別稱紅蘇、赤蘇，屬一年生唇形科紫蘇屬草本植物，在我國常作為蔬菜、藥用植物及油料作物進行栽培，已有2 000多年的栽培歷史[1]。紫蘇根腐病是國內外紫蘇栽培中常見的病害之一，致病菌為半知菌鏈孢霉真菌，以土壤為媒介進行傳播，危害較為嚴重，嚴重影響紫蘇的產量和品質，如何提高紫蘇根腐病抗性已成為紫蘇栽培中急需解決的關鍵問題[2]。菌根真菌是土壤中存在的一類可與植物根系形成有益共生體的微生物，主要有內生菌根、外生菌根及內外生菌根三大類型。眾多研究證實，菌根真菌可以改善植物根系的生態環境，促進植物生長，提高植物抵御不良環境的能力，尤其在提高植物抗病性方面作用顯著[3-5]。韓亞楠等研究表明，接種AM真菌可顯著提高連作西瓜的植株生物量，并對西瓜枯萎病的發生具有一定的防治效果[6]；張淑彬等研究表明，接種叢枝菌根真菌可有效防止辣椒苗期疫霉病的發生，且不同菌種防治效果存在很大差異[7]；秦海濱等研究表明，接種叢枝菌根真菌可顯著提升黃瓜幼苗的生物量及保護酶活性，顯著提高立枯病抗性，降低發病率[8]；張茹琴等研究表明，4種外生菌根真菌均可與油松幼苗形成菌根，灰鵝膏菌對油松猝倒病防治效果最好[9]；趙菊蓮等研究認為，接種菌根真菌可顯著提升草莓的保護酶活性，提高對枯萎病的抗性[10]；劉東岳等研究表明，叢枝菌根真菌和植物根圍促生細菌同時接種可顯著提升黃瓜枯萎病抗性，且不同菌劑組合防治效果差異顯著[11]；湛蔚等研究表明，接種叢枝菌根真菌可明顯提升楊樹根系的超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質酶(CHT)及β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性，楊樹潰瘍病抗性效果顯著優于接種外生菌根真菌[12]。菌根真菌的生物學效應常因寄主植物而異[13]，而目前尚未見關于菌根真菌對紫蘇根腐病抗性的影響研究報道。因此，本研究以奇蘇1號紫蘇為試驗材料，分析不同菌根真菌對紫蘇根腐病抗性的影響，并對其機制進行研究，以期為紫蘇根腐病的生物防治提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紫蘇品種為奇蘇1號，由貴州省農業科學院油菜研究所提供。供試叢枝菌根真菌為摩西球囊霉(Glomusmosseae)，外生菌根真菌為褐黃牛肝菌(Boletusluridus)，均由北京市農林科學院菌根真菌種質庫提供；紫蘇根腐病病原菌半知菌鏈孢霉真菌由筆者所在實驗室自主分離保存；供試基質為草炭蛭石(1 ∶1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗于2016年8月15日開始實施，選取長勢一致的奇蘇1號幼苗180株，分別定植于30 cm×40 cm 的花盆中，每盆1株，栽培基質為滅菌的草炭蛭石。試驗共設置3個處理，即分別于定植前接種15 g叢枝菌根真菌(AMF)、接種15 g外生菌根真菌(ECMF)及接種滅菌的15 g菌根真菌(CK)，每處理20盆，重復3次，共計180株，試驗期間給予各處理正常的水肥管理。定植90 d后，測定各處理的菌根侵染率。侵染成功后，接種半知菌鏈孢霉真菌，隨水澆于根際4周，接種量為2.0×106CFU/g土。

1.2.2 測定指標及方法 菌根侵染率采用Phillips等的方法[14]進行測定，菌根侵染率=侵染菌根段數/檢測菌根段數×100%；病情指數調查方法：自接種半知菌鏈孢霉真菌起，各處理每隔5 d調查1次，病情指數及防病效果按趙仕光等的方法[15]進行計算；自接種半知菌鏈孢霉真菌起，各處理每隔5 d進行一次生理生化指標測定，測定樣品為紫蘇根系。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用抑制NBT光還原比色法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法進行測定；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性采用苯丙氨酸比色法進行測定；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法；脯氨酸(Pro)含量測定采用磺基水楊酸提取法；幾丁質酶(CTH)及β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性參照Fink等的方法[16]進行測定。

1.2.3 數據分析 采用Excel 2010進行數據整理及作圖，用SPSS 18.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌根真菌對紫蘇根腐病病情指數及防病效果的影響

菌根真菌接種90 d后，接種AMF和ECMF的菌根侵染率分別達到82.36%和73.25%，對照無菌根產生。這說明，AMF和ECMF均可與紫蘇形成良好的互利共生關系，且紫蘇幼苗期AMF侵染率較高。菌根真菌對紫蘇根腐病病情指數及防病效果的影響如圖1所示，在整個試驗期間，3種處理的根腐病病情指數均隨著紫蘇的生長逐漸升高，其中，接種AMF真菌的病情指數始終保持最低，其余依次為接種ECMF的和CK(圖1-a)；接種半知菌鏈孢霉真菌30 d時，CK、AMF和ECMF的病情指數分別達到61.82、39.02和47.28，假定CK防效為0，接種AMF和ECMF的防效分別達到76.82%和 57.25%(圖1-b)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升紫蘇的根腐病防治效果，且接種AMF效果顯著優于ECMF。

2.2 菌根真菌對紫蘇根系保護酶活性的影響

由表1可知，接種半知菌鏈孢霉真菌后，3種處理條件下的紫蘇根系超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)4種保護酶活性均隨著時間的推移呈現先升高后降低的趨勢，且接種AMF的保護酶活性始終保持最高，依次為接種ECMF和對照(CK)。接種半知菌鏈孢霉真菌10 d時，對照(CK)的SOD、POD、CAT及PAL活性均達到最高，分別為32.28、261.58、272.53、2.02 U/(g·min)；接種AMF和ECMF的紫蘇根系SOD、POD及CAT酶活性均在接種半知菌鏈孢霉真菌20 d時達到最大，其中接種AMF的紫蘇根系SOD、POD及CAT酶活性分別為 43.05、372.83、342.36 U/(g·min)，較同期CK分別提升 49.95%、68%和222.67%，均達到極顯著差異水平(P<0.01)；接種ECMF的紫蘇根系SOD、POD及CAT酶活性分別為40.14、352.26、325.81 U/(g·min)，較同期CK分別提升39.81%、58.73%和111.91%，均達到顯著差異水平(P<0.05)；接種AMF和ECMF的紫蘇根系PAL酶活性均在接種半知菌鏈孢霉真菌15 d時達到最大，分別為2.42、 2.32 U/(g·min)，較同期CK分別提升81.95%和74.44%，分別達到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的保護酶活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF(P<0.05)。

2.3 菌根真菌對紫蘇根系丙二醛及游離脯氨酸含量的影響

菌根真菌對紫蘇根系丙二醛(MDA)含量的影響如圖2-a所示，接種半知菌鏈孢霉真菌后，3種處理條件下的紫蘇根系MDA含量均隨著時間的推移呈現先降低后升高的趨勢，且接種AMF的紫蘇根系MDA含量始終保持最低，其余依次為接種ECMF的和對照(CK)。接種半知菌鏈孢霉真菌5 d時，CK的根系MDA含量達到最低，為15.47 nmol/g，而接種AMF和ECMF的紫蘇根系MDA含量均在接種半知菌鏈孢霉真菌 10 d 時達到最低，分別為14.02、15.18 nmol/g。接種半知菌鏈孢霉真菌30 d時，CK、接種AMF和ECMF等3種處理的紫蘇根系MDA含量均達到最大，分別為47.88、34.22、40.02 nmol/g，接種AMF和ECMF的分別較CK降低28.53%和16.42%，分別達到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，根腐病病原菌侵染初期的紫蘇根系MDA含量略有下降，隨后逐漸升高，而接種菌根真菌的紫蘇根系MDA含量則顯著低于同期CK，且接種AMF效果顯著優于接種ECMF(P<0.05)。

由圖2-b可知，接種半知菌鏈孢霉真菌后，3種處理條件下的紫蘇根系游離脯氨酸(Pro)含量均隨著時間的推移呈現逐漸升高的趨勢，且接種AMF的紫蘇根系Pro含量始終保持最高，其余依次為接種ECMF的和對照(CK)。接種半知菌鏈孢霉真菌30 d時，CK、接種AMF和ECMF這3種處理的紫蘇根系Pro含量均達到最大，分別為39.03、53.28、46.81 μg/g，接種AMF和ECMF的分別較CK高36.51%和19.93%，與對照相比分別達到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的游離脯氨酸(Pro)含量， 且接種AMF效果顯著優于接種ECMF(P<0.05)。

表1 菌根真菌對紫蘇根系保護酶活性的影響

注：不同小寫字母表示同項指標不同處理差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同項指標同一處理不同時間之間差異顯著(P<0.05)。

2.4 菌根真菌對紫蘇根系幾丁質酶(CHT)和β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性的影響

菌根真菌對紫蘇根系幾丁質酶(CHT)活性的影響如圖 3-a所示，接種半知菌鏈孢霉真菌后，對照(CK)和接種ECMF的紫蘇根系CHT活性隨著時間的推移呈現先升高后降低的趨勢，而接種AMF的紫蘇根系CHT活性則呈現逐漸升高的趨勢，且接種AMF的CHT活性始終保持最高，其余依次為接種ECMF的和CK。在接種半知菌鏈孢霉真菌15 d時，CK處理的CHT活性達到最大，為23.26 U/mg，而接種AMF和ECMF處理的CHT活性則分別在接種半知菌鏈孢霉真菌 20 d 和30 d時達到最大，分別為38.22、28.26 U/mg，較同期CK分別提升345.97%和55.62%，分別達到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的幾丁質酶活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF的(P<0.05)。

由3-b可知，接種半知菌鏈孢霉真菌后，對照(CK)的紫蘇根系β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性隨著時間的推移呈現先升高后降低的趨勢，而接種AMF和ECMF的紫蘇根系GLU活性則呈現逐漸升高的趨勢，且接種AMF的GLU活性始終保持最高，其余依次為接種ECMF的和CK。接種半知菌鏈孢霉真菌15 d時，CK的紫蘇根系GLU活性達到最大，為 45.24 U/mg。接種AMF和ECMF的紫蘇根系GLU活性在接種半知菌鏈孢霉真菌30 d時達到最大，分別為183.72、143.86 U/mg，分別較同期CK提升431.29%和316.02%，分別達到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的β-1，3-葡聚糖酶活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF(P<0.05)。

3 結論與討論

菌根真菌可與植物根系形成互利共生體，參與植物的多種代謝過程，生物學效應廣泛[17-17]，尤其在誘導植物提高抗病性方面作用顯著，減輕病害發生程度[3-5]。本研究結果表明，AMF和ECMF均可與紫蘇形成菌根，侵染率分別達到82.36%和73.25%，對紫蘇根腐病的防效分別達到76.82%和57.25%。

植物在遭遇生物和非生物脅迫時，其體內的抗性防御系統會被啟動，以最大程度減少逆境對自身的傷害。大量研究表明，形成菌根的植株可以對病原菌的入侵產生快速的防御反應，可以明顯提高植物的保護酶活性，進而有效清除因病原菌入侵而形成的氧化逆境，防止對細胞產生更嚴重的氧化損失，提升植物對病原菌的抗性[19-21]。本研究結果表明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的SOD、POD、CAT及PAL活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF，其原因可能是由于AMF與紫蘇的親和度高于ECMF所致；MDA是反映細胞膜膜脂過氧化程度的重要指標。本研究結果表明， 接種菌根真菌可顯著降低半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的MDA，且接種AMF的降低效果顯著優于接種ECMF，這說明接種AMF的紫蘇細胞膜受損害程度最輕，其原因可能是接種AMF的紫蘇根系保護酶活性顯著高于接種ECMF和對照所致；游離脯氨酸含量是反映植物響應逆境強弱的重要指標。本研究結果表明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的游離脯氨酸含量，且接種AMF效果顯著優于接種ECMF，這說明接種AMF的紫蘇響應半知菌鏈孢霉真菌侵染的能力較強。

幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶通過破壞真菌細胞壁而抑制病原菌的生長，是植物對病原菌入侵的一種重要的防衛反應[22]。湛蔚等研究表明，接種AMF可明顯提高潰瘍病病菌侵染楊樹幼苗的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性，而接種ECMF則提升效果不明顯[12]。本研究結果表明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的幾丁質酶及β-1，3-葡聚糖酶活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF，這說明接種AMF的紫蘇防衛反應顯著優于接種ECMF，本研究結果與湛蔚等的研究結果[12]存在一定出入，其原因尚待進一步研究。

綜上所述，接種AMF可顯著提升紫蘇根腐病的防治效果，其原因是接種AMF可顯著提升紫蘇根系的保護酶活性，緩解病原菌入侵對植物細胞膜造成的傷害，提升了植物對病原菌入侵的響應能力，幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性顯著提升，顯著抑制了病原菌的生長。

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