桑樹潛在致敏原鑒定與生物信息學(xué)分析

劉 潮， 韓利紅， 宋培兵， 張亞萍， 唐利洲

(曲靖師范學(xué)院云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心/云南省高校云貴高原動(dòng)植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南曲靖 655011)

過(guò)敏屬于世界性的健康問(wèn)題，植物來(lái)源的過(guò)敏原能引起人類的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)，人們既可以從上呼吸道吸入，也可以通過(guò)存在于種類繁多的植物食品中的過(guò)敏原引起食物過(guò)敏反應(yīng)。近年來(lái)，食物過(guò)敏的患病率有所上升，在西方國(guó)家中，多達(dá)8%的幼兒和2%的成人受到影響[1]。桑樹是一種常見的落葉樹種，其葉片多汁，是桑蠶的主要飼料，曾有報(bào)道指出，桑樹花粉能引起呼吸過(guò)敏反應(yīng)和接觸性蕁麻疹[2]。桑樹的果實(shí)桑葚能直接食用或用作釀酒原料，也是常用的中草藥成分，過(guò)敏者食用桑葚能引發(fā)全身性蕁麻疹，導(dǎo)致呼吸困難、胸悶和腹絞痛等[3]。

致敏原屬于多個(gè)蛋白家族，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣。編碼序列和致敏原的三維(three dimensional，簡(jiǎn)稱3D)結(jié)構(gòu)對(duì)引起致敏性至關(guān)重要。大多數(shù)過(guò)敏原都比較小、穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)良好，這些蛋白質(zhì)家族多為種子貯藏蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和防御相關(guān)的蛋白質(zhì)——病程相關(guān)蛋白。序列或結(jié)構(gòu)相似的蛋白容易引發(fā)免疫球蛋白E(IgE)交叉反應(yīng)，可以通過(guò)電腦模擬的方法預(yù)測(cè)其致敏性。計(jì)算工具能相當(dāng)精確和快速地預(yù)測(cè)變應(yīng)原分子的表位位置，并將其用于確定分子結(jié)構(gòu)，從而確定B細(xì)胞表位[4]。在本研究中，篩選了63個(gè)桑樹潛在致敏原，分為13個(gè)家族。這些潛在的抗原表位的IgE結(jié)合殘基的功能研究將為后續(xù)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 致敏原蛋白序列的獲取

2016年10月，筆者通過(guò)食物過(guò)敏研究和資源計(jì)劃(FARRP)的致敏原蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.allergenonline.org)和致敏原命名委員會(huì)官方網(wǎng)站(http：//www.allergen.org/index.php)，下載了截至2016年8月4日公布的705條植物和真菌致敏原蛋白序列數(shù)據(jù)。

1.2 桑樹潛在致敏原的篩選

以致敏蛋白全序列為探針，通過(guò)Blast桑樹(Morusnotabilis)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)序列間的相似性篩選潛在的桑樹致敏蛋白。桑樹潛在致敏蛋白選擇閾值為序列一致性(identity)≥60%[5]和E值≤10-20(www.allergenonline.org)。

1.3 桑樹潛在致敏原的結(jié)構(gòu)和功能分析

利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.uniprot.org/)對(duì)篩選的潛在致敏原蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域和基因本體(gene ontology，簡(jiǎn)稱GO)功能分類分析。利用WEGO在線軟件(Web Gene Ontology Annotation Plotting，http：//wego.genomics.org.cn/)對(duì)蛋白GO富集度進(jìn)行計(jì)算。

1.4 桑樹潛在致敏原的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白同源三級(jí)結(jié)構(gòu)模型用Swiss-Model[6]構(gòu)建完成。3D結(jié)構(gòu)的可視化使用VMD 1.8.5 (http：//www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/vmd-1.8.5/)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹潛在致敏原的篩選

以從FARRP和Allergome數(shù)據(jù)庫(kù)上下載的致敏原蛋白為探針，BLAST桑樹蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，以序列一致性(identity)≥60%和E值≤10-20為篩選條件，共獲得143條桑樹潛在致敏原(其中4條注釋為Allergen的序列低于篩選條件)，詳見表1。

2.2 桑樹潛在致敏原的功能分類

GO注釋將基因產(chǎn)物分為細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程3類，可以對(duì)基因及其蛋白的功能進(jìn)行分類以了解其功能。在143條桑樹潛在致敏原中，有113條具有GO功能注釋，分析發(fā)現(xiàn)71條不同的GO注釋子條目，7類GO子分類基因作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分起作用，其中參與細(xì)胞和細(xì)胞部分組成的均占46.4%，參與細(xì)胞器結(jié)構(gòu)成分的占32.1%。在分子功能分類中，具有結(jié)合功能的蛋白占67.9%，具有催化活性的蛋白占25.0%，具有結(jié)構(gòu)分子活性的蛋白占14.3%。13類GO子分類基因參與了生物學(xué)過(guò)程，其中參與細(xì)胞過(guò)程的占39.3%，參與代謝過(guò)程的占28.6%，參與應(yīng)激反應(yīng)的占23.2%(圖1)。

2.3 桑樹潛在致敏原的家族分布

在143條桑樹潛在致敏原中共查詢到172個(gè)pfam保守功能域，分屬于49個(gè)pfam家族(圖2)，根據(jù)其所屬pfam家族共分為22類(表1)。其中熱休克蛋白家族含有HSP70(PF00012)、HSP20(PF00011)和HSP90(PF00183)3類結(jié)構(gòu)域，共有25條序列，該類蛋白是蛋白質(zhì)折疊復(fù)合體的重要成分，可保護(hù)植物免受脅迫的損傷[7]，關(guān)于該家族成員致敏原活性的報(bào)道較少。含有Profilin(PF00235)功能域的有3條序列，且與已知致敏原序列一致性較高，該類蛋白在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合中起作用，在多種植物的花粉、果實(shí)或種子中具有致敏原活性。肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(Pro_isomerase，編號(hào)PF00160)，也稱為親環(huán)素(cyclophilin)，在哺乳動(dòng)物中是免疫抑制劑環(huán)孢素A(CsA)的主要靶細(xì)胞組分，也具有分子伴侶和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，桑樹潛在致敏原中有12個(gè)成員含有Pro_isomerase功能域。類甜蛋白(thaumatin-like protein，簡(jiǎn)稱TLP)是一類能響應(yīng)脅迫的蛋白家族，多種植物水果或花粉的TLPs具有致敏原活性[8]，桑樹有4個(gè)潛在的TLP致敏原成員。捕光色素A-B結(jié)合蛋白在植物光合作用中發(fā)揮重要作用，在芹菜中的Api g 3具有致敏原活性[9]，桑樹潛在致敏原中有5個(gè)成員具有Chloroa_b-bind(PF00504)功能域。

有部分序列同時(shí)含有多個(gè)功能域，如L484_024225同時(shí)含有HSP90(PF00183)和HATPase_c(PF02518)2個(gè)功能域，L484_020224同時(shí)含有Glyco_hydro_18(PF00704)和Thaumatin(PF00314)2個(gè)功能域，L484_006986則同時(shí)含有Glyco_hydro_17(PF00332)、Pkinase(PF00069)和Profilin(PF00235)3個(gè)功能域。

2.4 桑樹潛在致敏原的結(jié)構(gòu)和功能分析

蛋白初級(jí)結(jié)構(gòu)是高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，具有序列相似性的蛋白，其三維結(jié)構(gòu)可能有明顯不同，蛋白序列或結(jié)構(gòu)，尤其是高級(jí)結(jié)構(gòu)在其發(fā)揮功能過(guò)程中起決定作用，蛋白三維結(jié)構(gòu)表層的氨基酸殘基具有參與致敏活性的可能。Ⅰ型致敏原具有多樣的生理生化特征、多樣的初級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)只有正確折疊，才具有生物學(xué)活性，為充分了解桑樹潛在致敏原的致敏潛力，筆者以部分蛋白質(zhì)為例，構(gòu)建了蛋白質(zhì)三維模型，以便更準(zhǔn)確地了解蛋白質(zhì)的致敏性。

表1 桑樹潛在致敏原蛋白信息

續(xù)表1

基因編號(hào)E值相似度(%)致敏原物種蛋白注釋L484_0060231.00×10-6470Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060263.00×10-6773Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060316.00×10-6369Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060324.00×10-5868Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060332.00×10-6162Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060345.00×10-7368Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白L484_0252137.00×10-7382Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白L484_0252147.00×10-8180Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白L484_0252151.00×10-7376Cas s 9歐洲栗胞質(zhì)Ⅰ型小熱激蛋白乙二醛酶 (PF00903):乙二醛酶,博來(lái)霉素抗性蛋白,雙加氧酶超家族L484_0180491.00×10-16377Ory s GLO I水稻乙二醛酶L484_0072412.00×10-15271Ory s GLO I水稻乙二醛酶L484_0036614.00×10-16176Ory s GLO I水稻乙二醛酶L484_0003611.00×10-4573Ory s GLO I水稻乙二醛酶Chloroa_b-bind (PF00504):葉綠素a/b結(jié)合蛋白L484_0187397.00×10-11867Api g 3白芹葉綠素a/b結(jié)合蛋白L484_0200162.00×10-15077Api g 3白芹葉綠素a/b結(jié)合蛋白L484_0138664.00×10-16284Api g 3白芹葉綠素a/b結(jié)合蛋白L484_0028557.00×10-17488Api g 3白芹葉綠素a/b結(jié)合蛋白L484_0028568.00×10-17387Api g 3白芹葉綠素a/b結(jié)合蛋白HATPase_c (PF02518)/HSP90 (PF00183):組氨酸激酶,DNA螺旋酶B和類熱激蛋白P90 ATP酶L484_020213065Asp f 12煙曲霉熱激蛋白 P90L484_024225067Asp f 12煙曲霉熱激蛋白 P90L484_024226067Asp f 12煙曲霉熱激蛋白 P90EF-hand_7 (PF13499):EF手型結(jié)構(gòu)域(EF-hand domain pair)L484_0272301.00×10-4277Ole e 3油橄欖鈣結(jié)合花粉致敏原(Polcalcin)L484_0062373.00×10-3070Phl p 7梯牧草PolcalcinL484_0272322.00×10-2063Phl p 7梯牧草PolcalcinRibosomal_L12(IPR027534)/Ribosomal_L3 (PF00297):核糖體蛋白L12和L3L484_0032568.00×10-2760Alt a 12鏈格孢60S酸性核糖體蛋白L484_0137778.00×10-3375Pru du 5扁桃60S酸性核糖體蛋白L484_0090002.00×10-4077Pru du 5扁桃60S酸性核糖體蛋白L484_001372068Asp f 23煙曲霉60S核糖體蛋白L3L484_004471067Asp f 23煙曲霉60S核糖體蛋白L3Glyco_hydro_17 (PF00332):糖基水解酶家族17/ 內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0006001.00×10-3363Ole e 10油橄欖葡聚糖內(nèi)酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0252355.00×10-3460Ole e 10油橄欖葡聚糖內(nèi)酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0118592.00×10-3260Ole e 10油橄欖葡聚糖內(nèi)酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_003338066Ole e 9油橄欖葡聚糖內(nèi)酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_027431065Ole e 9油橄欖葡聚糖內(nèi)酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0165656.00×10-13563Hev b 2橡膠樹葡聚糖內(nèi)酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0165742.00×10-15160Hev b 2橡膠樹葡聚糖內(nèi)酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_004210069Hev b 2橡膠樹葡聚糖內(nèi)酯-1,3-β-葡萄糖苷酶Glyco_hydro_18(PF00704):糖苷水解酶家族18L484_0224812.00×10-8266Hev b 14橡膠樹酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶L484_0224821.00×10-8770Hev b 14橡膠樹酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶L484_0202241.00×10-8463Hev b 14橡膠樹酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶L484_0114862.00×10-10280Hev b 14橡膠樹酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶Pro_isomerase (PF00160):親環(huán)素型肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶/ CLDL484_0160611.00×10-6974Sola l 5番茄親環(huán)素L484_0249571.00×10-11188Cat r 1長(zhǎng)春花親環(huán)素L484_0160632.00×10-10681Cat r 1長(zhǎng)春花親環(huán)素L484_0160643.00×10-6081Cat r 1長(zhǎng)春花親環(huán)素

續(xù)表1

基因編號(hào)E值相似度(%)致敏原物種蛋白注釋L484_0138973.00×10-3662Asp f 27煙曲霉親環(huán)素L484_0245325.00×10-9776Sola l 5番茄親環(huán)素L484_0087156.00×10-2768Cat r 1長(zhǎng)春花親環(huán)素L484_0220051.00×10-8571Sola l 5番茄親環(huán)素L484_0023812.00×10-2461Asp f 27煙曲霉親環(huán)素L484_0174751.00×10-7266Asp f 27煙曲霉親環(huán)素L484_0239734.00×10-6660Sola l 5番茄親環(huán)素L484_0275742.00×10-7162Cat r 1長(zhǎng)春花親環(huán)素Pkinase(PF00069)/ Usp(PF00582)/ Pkinase_Tyr (PF07714):蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,絡(luò)氨酸激酶L484_0082132.00×10-15064Sal k 2豬毛菜蛋白激酶L484_0198637.00×10-14561Sal k 2豬毛菜蛋白激酶L484_0138435.00×10-13960Sal k 2豬毛菜蛋白激酶L484_0134664.00×10-15765Sal k 2豬毛菜蛋白激酶L484_0030017.00×10-15664Sal k 2豬毛菜蛋白激酶TIM(PF00121):磷酸丙糖異構(gòu)酶L484_0249516.00×10-11161Tri a 31普通小麥磷酸丙糖異構(gòu)酶L484_0252393.00×10-12474Tri a 31普通小麥磷酸丙糖異構(gòu)酶L484_0107433.00×10-14978Tri a 31普通小麥磷酸丙糖異構(gòu)酶Pectinesterase(PF01095)/ PMEI(PF04043):植物轉(zhuǎn)化酶/ 果膠甲基酯酶抑制劑L484_0255947.00×10-13666Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0104671.00×10-14960Sal k 1豬毛菜果膠酯酶L484_0007993.00×10-14265Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0111205.00×10-13175Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0111155.00×10-13762Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0111182.00×10-13160Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0111191.00×10-13563Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶其他Pfam家族L484_0090416.00×10-6151Alt a 7鏈格孢YCP4 蛋白L484_0251346.00×10-12274Tri a 32普通小麥1-Cys過(guò)氧化還原酶L484_0139581.00×10-10667Cand a 3白念珠菌1-Cys過(guò)氧化還原酶L484_0000528.00×10-5095Sal k 3豬毛菜不依賴于維生素B12的甲硫氨酸合成酶L484_0000341.00×10-3691Sal k 3豬毛菜不依賴于維生素B12的甲硫氨酸合成酶L484_009365089Sal k 3豬毛菜不依賴于維生素B12的甲硫氨酸合成酶L484_003436076Sal k 3豬毛菜不依賴于維生素B12的甲硫氨酸合成酶L484_019026065Sola l 2番茄酸性β-呋喃果糖苷酶L484_0138872.00×10-10960Mus a 2小果野蕉Ⅰ類幾丁質(zhì)酶L484_0042735.00×10-3661Act d 4美味獼猴桃?guī)€基蛋白酶抑制劑L484_023933073Tri a 34普通小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶L484_006727087Tri a 34普通小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶L484_006912087Tri a 34普通小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶L484_0176563.00×10-15767Tri a 34普通小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶L484_0095762.00×10-2363Tri a 41普通小麥NFKB 1線粒體泛素連接酶活化子L484_0170681.00×10-7680Cor a 13歐洲榛油質(zhì)蛋白L484_0205536.00×10-6563Cor a 12歐洲榛油質(zhì)蛋白L484_0039562.00×10-14461Hev b 7橡膠樹馬鈴薯塊莖特異蛋白L484_0039582.00×10-15461Hev b 7橡膠樹馬鈴薯塊莖特異蛋白L484_0132392.00×10-15261Hev b 7橡膠樹馬鈴薯塊莖特異蛋白L484_0255024.00×10-4460Cur l 3新月彎孢菌細(xì)胞色素CL484_0106767.00×10-12578Pis v 4阿月渾子超氧化物歧化酶L484_0112252.00×10-13186Hev b 10橡膠樹超氧化物歧化酶L484_003380064Sola l 2番茄β-呋喃果糖苷酶L484_0081962.00×10-15570Pyr c 5西洋梨異黃酮還原酶相關(guān)蛋白L484_009016086Bet v 6疣皮樺苯基香豆素芐基醚還原酶

續(xù)表1

基因編號(hào)E值相似度(%)致敏原物種蛋白注釋L484_0102551.00×10-3281Pru p 7巴旦木赤霉素調(diào)節(jié)蛋白L484_0114262.00×10-5283Tri a 45普通小麥延伸因子ⅠL484_0115004.00×10-2873Pru p 7巴旦木赤霉素調(diào)節(jié)蛋白L484_0131725.00×10-5673Hum j 1葎草未知蛋白L484_0185642.00×10-18080Pyr c 5西洋梨異黃酮還原酶相關(guān)蛋白L484_0185654.00×10-18079Pyr c 5西洋梨異黃酮還原酶相關(guān)蛋白

Bet v 1成員屬于PR10家族，在植物的花粉、種子和果實(shí)中高表達(dá)，在多種植物的花粉和果實(shí)中具有過(guò)敏原活性[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，桑葚中的1個(gè)17 ku蛋白疑似PR10家族的Bet v 1，是主要的過(guò)敏原[3]。Bet v 1的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成1個(gè)大的疏水口袋，具有儲(chǔ)存或載體蛋白的功能[11]，能夠結(jié)合黃酮類化合物[12]。在本研究中，4個(gè)已被初步鑒定為致敏原的成員屬于該家族，具有引起患者致敏反應(yīng)的潛力。L484_001696的3-D結(jié)構(gòu)模型具有典型的Bet v 1三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步說(shuō)明該家族桑樹潛致敏原具有致敏潛力，值得深入研究。

TLP屬于植物病程相關(guān)蛋白第5家族，能被多種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在多種水果和作物中具有過(guò)敏原活性[8，13-14]。TLP蛋白3D結(jié)構(gòu)中的功能域Ⅱ表現(xiàn)出非常保守的構(gòu)象，預(yù)測(cè)這些氨基酸序列為主要的IgE結(jié)合表位[15]。L484_022590蛋白具有保守結(jié)構(gòu)域THN，其三級(jí)結(jié)構(gòu)由3個(gè)功能域組成：Domain Ⅰ為N端核心功能域，由2個(gè)反向平行的β片層組成；Domain Ⅱ由半胱氨酸二硫鍵形成的3個(gè)較短的α螺旋構(gòu)成；Domain Ⅲ由2個(gè)β折疊和1個(gè)大環(huán)構(gòu)成[15]。桑樹中有4個(gè)蛋白與致敏蛋白Pru p 2具有60%以上的序列一致性。預(yù)測(cè)的L484_022590三維結(jié)構(gòu)(圖3)與典型TLP非常相似，其具體致敏活性值得研究。

RlpA-like_DPBB家族包含保守的DPBB(double-psi beta-barrel)折疊，DPBB功能域的N端常常連接花粉致敏原[16]。Kiwellin是獼猴桃中重要的富含半胱氨酸的RlpA-like_DPBB家族致敏原蛋白，來(lái)自綠色獼猴桃的Act d 5蛋白大約為22 ku，由N端kissper功能域和C端KiTH功能域組成，其中后者又由具有2個(gè)擴(kuò)展環(huán)的6個(gè)β片層構(gòu)成的筒體構(gòu)成[17]。本研究中搜索到5個(gè)桑樹潛在致敏原與獼猴桃Act d 5具有高度一致性。L484_007509的三維結(jié)構(gòu)具有典型的kissper和KiTH功能域，具有致敏潛力。

幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白家族屬于碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族18(carbohydrate-binding module family 18，簡(jiǎn)稱CBM18)，具有幾丁質(zhì)識(shí)別或結(jié)合活性，存在于多種植物與真菌中，能結(jié)合N-乙酰葡萄糖胺[18]。該家族成熟蛋白N端的Chitin bind 1(PF00187)功能域能識(shí)別或結(jié)合幾丁質(zhì)亞基。本研究中發(fā)現(xiàn)4個(gè)該家族桑樹潛在致敏原蛋白，與小果野蕉Mus a 2或巴西橡膠Hev b 6序列一致性均達(dá)70%以上，并構(gòu)建了L484_024568的三維結(jié)構(gòu)(圖3)。

EF-hand家族屬于鈣結(jié)合蛋白，EF-hand基序包含螺旋-環(huán)-螺旋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，能在環(huán)上結(jié)合鈣離子。源自藜、狗牙根、油橄欖和貓尾草等植物花粉中的EF-hand家族成員具有致敏原活性。本研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)桑樹潛在過(guò)敏原屬于該家族，構(gòu)建了L484_027230蛋白三維結(jié)構(gòu)(圖3)，這些成員具有典型EF-hand家族蛋白的類似結(jié)構(gòu)，很可能在桑樹的花粉中具有致敏原活性。

3 討論與結(jié)論

過(guò)敏性疾病是臨床上的常見病癥，因此，過(guò)敏反應(yīng)性疾病的診斷和治療的關(guān)鍵是分離和鑒定出引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的致敏原。傳統(tǒng)鑒定和獲得致敏蛋白的方法需要經(jīng)過(guò)表達(dá)、純化、結(jié)晶、磁共振或X射線衍射等復(fù)雜的試驗(yàn)步驟，在實(shí)際操作中會(huì)遇到諸多問(wèn)題。目前，隨著基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的增加，以及生物信息學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了多種比對(duì)和結(jié)構(gòu)建模的軟件，這些預(yù)測(cè)結(jié)果大大縮減了科研工作量，使研究工作更有針對(duì)性。

植物花粉和果實(shí)過(guò)敏的發(fā)病率都很高，目前在很多植物中已經(jīng)鑒定出多種植物源致敏原。桑樹花粉和果實(shí)均能引起人的過(guò)敏反應(yīng)[2-3]，而對(duì)桑樹致敏原的研究較少。全面了解桑樹內(nèi)源性致敏原，包括致敏原的種類和數(shù)量、致敏原的時(shí)空表達(dá)特征等，對(duì)于桑樹過(guò)敏癥和交叉反應(yīng)的診斷具有重要的參考價(jià)值。本研究以已知致敏原序列為探針，搜索桑樹蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得143條潛在致敏原序列。GO注釋顯示，它們屬于細(xì)胞部分，參與細(xì)胞過(guò)程，說(shuō)明它們主要為細(xì)胞建成成分，參與了重要的細(xì)胞生物學(xué)功能，具有結(jié)合活性，參與代謝過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)，說(shuō)明這些蛋白能與其他組分結(jié)合，可能具有抗原抗體結(jié)合活性，是這些蛋白具有致敏性的重要前提。

桑樹致敏原蛋白結(jié)構(gòu)多樣，本研究共查詢到77個(gè)pfam保守結(jié)構(gòu)域，主要包括HSP70、Profilin、Tubulin、Tubulin_C、Bet_v_1、Chloroa_b-bind和RlpA-like_DPBB結(jié)構(gòu)域等。其中Bet v 1家族、Profilin家族、Thaumatin家族、kiwellin家族是較常見的致敏原類型，在多種植物的花粉和果實(shí)中具有過(guò)敏原活性[10，13-14，17]，有些蛋白具有抗真菌活性。本研究中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)桑樹潛在致敏原成員屬于這些家族，其蛋白與已鑒定的致敏原蛋白具有較高的序列一致性，其三級(jí)結(jié)構(gòu)與已鑒定的致敏原蛋白結(jié)構(gòu)類似，其致敏潛力值得深入研究。本研究也發(fā)現(xiàn)，部分桑樹潛在致敏原蛋白屬于糖基水解酶、糖苷水解酶和果膠酯酶家族，這些酶類參與了重要的細(xì)胞進(jìn)程，關(guān)于其致敏原活性的報(bào)道較少，主要在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cianferoni A，Spergel J M.Food allergy：review，classification and diagnosis[J]. Allergology International，2009，58(4)：457-466.

[2]Navarro A M，Orta J C，Sanchez M C，et al.Primary sensitization toMorusalba[J]. Allergy，1997，52(11)：1144-1145.

[3]Choi J H，Sim J K，Oh J Y，et al.An IgE-mediated allergic reaction caused by mulberry fruit[J]. Allergy Asthma & Immunology Research，2015，7(2)：195-198.

[4]Nair S，Kukreja N，Singh B P，et al.Identification of B cell epitopes of alcohol dehydrogenase allergen ofCurvularialunata[J]. PLoS One，2011，6(5)：e20020.

[5]Hileman R E，Silvanovich A，Goodman R E，et al.Bioinformatic methods for allergenicity assessment using a comprehensive allergen database[J]. International Archives of Allergy and Immunology，2002，128(4)：280-291.

[6]Bordoli L，Kiefer F，Arnold K，et al.Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace[J]. Nature Protocols，2008，4(1)：1-13.

[7]Morano K A.New tricks for an old dog[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2007，1113(1)：1-14.

[8]Breiteneder H.Thaumatin-like proteins-a new family of pollen and fruit allergens[J]. Allergy，2004，59(5)：479-481.

[9]Faeste C K，Jonscher K R，Sit L，et al.Differentiating cross-reacting allergens in the immunological analysis of celery (Apiumgraveolens) by mass spectrometry[J]. Journal of AOAC International，2010，93(2)：451-461.

[10]Soeria-Atmadja D，?nell A，Kober A，et al.Multivariate statistical analysis of large-scale IgE antibody measurements reveals allergen extract relationships in sensitized individuals[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology，2007，120(6)：1433-1440.

[11]Fernandes H，Michalska K，Sikorski M，et al.Structural and functional aspects of PR-10 proteins[J]. The FEBS Journal，2013，280(5)：1169-1199.

[12]von Loetzen C S，Jacob T，Hartl-Spiegelhauer O，et al.Ligand recognition of the major birch pollen allergen Bet v 1 is isoform dependent[J]. PLoS One，2015，10(6)：e0128677.

[13]Esteve C，D’Amato A，Marina M L，et al.In‐depth proteomic analysis of banana (Musaspp.) fruit with combinatorial peptide ligand libraries[J]. Electrophoresis，2013，34(2)：207-214.

[14]Hegde V L，Ashok K H G，Sreenath K，et al.Identification and characterization of a basic thaumatin-like protein (TLP 2)as an allergen in sapodilla plum(Manilkarazapota)[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2014，58(4)：894-902.

[15]Leone P，Menu-Bouaouiche L，Peumans W J，et al.Resolution of the structure of the allergenic and antifungal banana fruit thaumatin-like protein at 1.7-A[J]. Biochimie，2006，88(1)：45-52.

[16]Jorgenson M A，Chen Y，Yahashiri A，et al.The bacterial septal ring protein RlpA is a lytic transglycosylase that contributes to rod shape and daughter cell separation inPseudomonasaeruginosa[J]. Molecular Microbiology，2014，93(1)：113-128.

[17]Offermann L R，Giangrieco I，Perdue M L，et al.Elusive structural，functional，and immunological features of Act d 5，the green kiwifruit kiwellin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2015，63(29)：6567-6576.

[18]Wright H T，Sandrasegaram G，Wright C S.Evolution of a family ofN-acetylglucosamine binding proteins containing the disulfide-rich domain of wheat germ agglutinin[J]. Journal of Molecular Evolution，1991，33(3)：283-294.

[19]Valenta R，Duchene M，Ebner C，et al.Profilins constitute a novel family of functional plant pan-allergens[J]. The Journal of Experimental Medicine，1992，175(2)：377-385.