利用實時熒光定量PCR特異檢測多環芳烴污染土壤中的外源降解菌

張 聞， 鄭立穩， 王加寧， 黃玉杰， 張思玉， 高永超， 陳貫虹， 郭書海，， 季 蕾， 王磊磊

[1.齊魯工業大學(山東省科學院)/山東省科學院生態研究所/山東省應用微生物重點實驗室，山東濟南 250103；2.中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧沈陽 110164]

多環芳烴是環境中廣泛存在的一類典型持久性有機污染物，污染范圍大、涉及面廣，并呈現加重的趨勢[1-2]，治理多環芳烴污染迫在眉睫。國內外學者對多環芳烴污染修復技術開展了大量研究，主要有物理、化學、生物修復[3-6]，其中生物修復因具有成本低、無二次污染、可大面積應用等優點而受到重視。生物強化法是生物修復的重要手段之一，其主體是人為投加有高效降解能力的降解菌或菌群，這些微生物可以通過從土著菌中篩選馴化獲得、對土著菌進行物理化學誘變后篩選獲得、通過基因工程構建獲得，降解菌的濃度可控，降解能力強。外源降解菌進入污染環境后，會受污染物脅迫，并與土著菌競爭，其存活和增殖情況在整個修復期內呈現動態變化。外源降解菌的豐度與分布直接關系著修復效果。對降解菌進行實時定量追蹤，可準確了解其進入土壤后的存活、增殖情況，從而為改進修復時菌劑的投加量和投加方式提供理論指導，因此有必要開發出特定外源降解菌在土壤中數量的檢測方法。

傳統的微生物數量檢測方法有稀釋平板法、血球計數板法等，但這些方法只能對樣品中的全部微生物進行無差別的計數，無法對樣品中的微生物進行準確的種屬區分，因此無法排除環境樣品中土著微生物的干擾對特定菌株進行數量檢測。實時熒光定量PCR技術[7-10]可以準確定量特定類群微生物的數量，具有靈敏度高、精確性好、特異性強、安全快速等優點[11-13]，已被應用于檢測環境樣品中的目標微生物。目前，基于實時熒光定量PCR技術對有機污染土壤及其他環境樣品中微生物的定量方法多以16S/18S rDNA、ITS或功能基因為目的基因[14-15]，研究多集中于某類或某幾類土著降解菌，缺少對某種特定外源降解菌進入環境后數量、分布情況的關注。本研究針對外源多環芳烴降解菌，篩選出其特異性基因序列及特異引物，構建實時熒光定量PCR反應體系，將其應用于污染土壤中外源降解菌的檢測，并驗證其可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

多環芳烴降解菌假單胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1菌株分離自多環芳烴污染土壤，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No. 12596。將菌株送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行基因組框架圖測序，得到編碼基因預測結果。

1.2 試驗土壤

土壤樣品分別采自山東濟南(36°42′29″N，117°04′40″E)、浙江永康(29°00′17″N，120°14′36″E)地區的農田，采樣時間為2017年1月。2種土壤樣品質地分別為壤土、沙壤土，分別命名為土1、土2。土壤樣品的部分理化性質如下：pH值分別為8.25、5.57；有機質含量分別為5.2%、3.1%；陽離子交換量分別為22.6、11.8 cmol/kg；全氮含量分別為2.28、2.05 g/kg；全磷含量分別為0.96、0.42 g/kg；全鉀含量分別為13、16 g/kg。檢測土壤中多環芳烴模式化合物菲的本底含量分別為194、748 μg/kg，向土壤中加入菲使其濃度為 100 mg/kg，老化2周，以刺激土著降解菌的生長。

1.3 主要試劑

LB培養基，購自北京索萊寶科技有限公司；TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer(無Mg2+，100 mmol/L Tris-HCl，pH值為8.8，25 ℃，500 mmol/L KCl，0.8%乙基苯基聚乙二醇)、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10 mmol/L)、Marker、6×DNA Loading Dye、10×TAE(400 mmol/L Tris-acetate，10 mmol/L EDTA，pH值為8.0)、引物、細菌基因組DNA抽提試劑盒(B518225)、土壤基因組DNA抽提試劑盒(B618763)、4S Red Plus核酸染色劑(BBI A606695)、瓊脂糖-柱式DNA膠回收試劑盒(SK8131)、一步法快速感受態細胞制備試劑盒(SK9307)、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(SK8191)，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD? 18-T Vector，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 主要儀器

HC-2518R高速冷凍離心機，購自安徽中科中佳科學儀器有限公司；DYY-6C型穩壓穩流電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司；FR980凝膠成像系統，購自上海復日科技有限公司；TU-1901紫外分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司；PCR反應擴增儀，購自美國Bio-Rad公司；3730XL測序儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；StepOne型熒光定量PCR儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.5 DNA提取

使用細菌及土壤基因組DNA抽提試劑盒，分別提取菌株PPZ-1、土壤樣品的DNA。提取結果經1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，電泳條件為1×TAE，150 V，100 mA，20 min。通過凝膠成像系統分析試驗結果，于微量分光光度計下檢測DNA濃度及D260 nm/D280 nm，-20 ℃保存備用。

1.6 特異性基因序列的篩選與引物設計

根據菌株PPZ-1基因組測序結果，將編碼基因分別在通用功能數據庫基因本體(gene ontology，簡稱GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，簡稱KEGG)、直系同源序列聚類分析(cluster of orthologous groups of proteins，簡稱COG)、非冗余蛋白質序列數據庫(non-redundant protein database，簡稱NR)、蛋白質家族數據庫(protein family database，簡稱Pfam)、Swiss-Prot蛋白質序列數據庫(Swiss-Prot protein sequence database，簡稱Swiss-Prot)等中進行Blast比對，篩選未注釋到的基因序列，這些序列即為該菌株可能的特異性基因序列。針對得到的基因序列，使用PrimerPremier 5.0分別設計引物。

1.7 PCR擴增及電泳

PCR擴增體系為25 μL：0.5 μL模板DNA，0.5 μL引物F(10 μmol/L)，0.5 μL引物R(10 μmol/L)，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，2.5 μLTaqbuffer(10×)，2.0 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.2 μLTaq酶(5 U/μL)，18.3 μL ddH2O。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃修復延伸8 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查，電泳條件同“1.5”節。通過凝膠成像系統分析試驗結果，選擇菌株擴增成功，而土壤樣品擴增失敗的基因序列及相應引物作為后續目標序列及特異性引物，確定特異性序列，切膠回收，克隆測序。

1.8 質粒標準品的制備

將目的條帶用手術刀切下，用試劑盒回收，與T載體連接，轉化進入大腸桿菌感受態細胞內，涂布于氨芐青霉素抗性平板，置于37 ℃環境中培養24 h，挑選單克隆于液體LB培養基中培養24 h，提取質粒；以質粒為模板進行PCR擴增，獲得陽性目標質粒。質粒經測序鑒定無誤后用紫外分光光度計測定質粒的D260 nm，換算成拷貝數。

1.9 實時熒光定量PCR標準曲線、反應體系及條件

10倍梯度稀釋構建好的質粒，90 μL稀釋液+10 μL質粒。實時熒光定量PCR擴增體系為20 μL：10 μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，0.4 μL 10 μmol/L引物F，0.4 μL 10 μmol/L引物R，7.2 μL ddH2O，2 μL DNA模板。實時熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，45個循環。

1.10 實時熒光定量PCR法的應用可行性

向2種土壤樣品中分別投加活化后的PPZ-1菌液并混合均勻，使其投加量分別為2.0×109、2.0×107、2.0×105、2.0×103CFU/g，分別標為1、2、3、4，同時設不加菌液的土壤樣品作為對照，記作CK。提取土壤樣品的DNA，將其稀釋適當倍數上機進行實時熒光定量PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 菌株特異性基因序列與引物

根據菌株PPZ-1的基因組測序結果，所篩選的未注釋到的基因序列如下，這些序列即為該菌株可能的特異性基因序列：(1)ATGAGCCACCTCTCCGCCGCCCAGATAAATTCCAT-GGTGGATATAGAATCGGCGCGGACTGATCAAATGCGCACCG-ACGGGTATGCTGTCTGCGGACCTCTCGATATCGACCAGCTTC-AACGGGACATCCACCATGCGCCCAGGCAGATTGCTGCCGTA-ACGGGCTGCGGAACACAGATGACGTTCCGGCAGCGGCACAC-TCAAGCGGTAGAAAACGCTCGTCGTTAA；(2)ATGTTCTCCC-ATGAGTCTCGCAGGCCCCGTGCCGGGTGGGTAGTGACGGTTC-ACCTCTGGTGGCAGATGCGTGGAATGTTGGACCAAGTGGCG-CACTTCCACTTGGAAAAATTCATCAGCGCAGGTTTGCGCGGG-TTTTTCTCGGGGGCGGGAGGTGTTGCTGTTCAGGCAGCGTGT-TTGTTCGGCGCGAACTTGCAGTTCGGTAATTTTGAGGGGGTA-ATGCTTCCTGCTAATCAGTTCGTTGTACCCTGCATCGTTGCCT-TGATAGAGTTCAGTGAACGCAAGGGCAATAGGCCCCGCACA-ATGGTTGGCCACTTTCCCTACCCCGTCAGTGTCTAG；(3)ATG-CTGCCCGGGCCCGTGCTGGGCGTAGACGCGGTCGCGGTGTTT-GAGGTTTACGTGCAGCTTTGCCTTTTTCCGAGTAGGCCAGGC-ACTGCCGCAGATCTTGCAAACATGAGCTACAAGCTCTTCGGC-CATGGTTGCCTCCAGGGTGGCGGGTTATGGGCAGCAGAATTG-GCCGCCGCAGTAAAAGCGGCCGTCGCCGTCATGGTTAGGGA-GGCCGTATTTATTTCCGCAACCGCAGCAAGCAACCTCGCGCA-GCCCTTCGATAAGCTCGGCTCCGCAAGCAGGACAGTTGCCTT-CGTTCTCGGTGACTTCCTGTTTGCCAACCAGCTCACCGCAGG-ATGA；(4)ATGCAGTTTGATTTTCTAAAGATGCTTTCGCTATA-TACCCCTGAGCAGCGTGAAAGATGGCCAAATGATATGTCGC-AATGCTTCGGTACTTGTTTCATCGTTATGTGGCTCATCAATGT-TTTGATTAAACATTTCAAACTGAGCCTGCGGCCCTATATGAAT-GGAGCTACTGAGGTTGGTATGGCGGTGGGCAATGAGAAGCGG-CGGAAGGAGAACCTGCCCGCGATATAG。

針對以上基因序列分別設計引物，引物核苷酸序列見表1。

表1 引物核苷酸序列

分別利用上述引物對假單胞菌PPZ-1、土1-CK、土2-CK的DNA進行PCR擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。由圖1可知，4對引物均能成功擴增菌株DNA。第1、第3、第4對引物在土壤樣品DNA相同位置均有模糊條帶存在，說明其對土壤樣品DNA擴增出了相同大小的基因片斷，其特異性不足以排除土壤背景DNA的干擾。第2對引物在土壤樣品相同位置無明顯條帶，特異性較好。土壤性質在一定程度上決定了土著微生物的群落結構和多樣性。土1與土2性質差異明顯，它們質地不同，分屬壤土和砂壤土；pH值不同，分屬堿性土和酸性土；有機質含量、營養元素等也有所不同，因此所孕育的微生物種群會存在差異。土1-CK、土2-CK中有豐富的DNA片斷，以其DNA擴增產物與菌株PPZ-1進行比對，可有效篩選出菌株PPZ-1的特異性引物。對第2對引物在NCBI上通過Blast特異性檢驗，無顯著匹配結果，表明該組引物在NCBI數據庫中也是特異的。因此，將第2對引物及其所對應的基因序列確定為菌株PPZ-1的特異性引物及特異性基因序列，據此構建實時熒光定量PCR檢測體系。

2.2 實時熒光定量PCR檢測體系

構建好的質粒濃度為106.02 ng/μL，換算成拷貝數為 3.46×1010copies/μL。標準曲線最高拷貝數為1.73×108copies/μL。梯度稀釋樣品擴增曲線如圖2所示，每個稀釋度有3個平行，從左到右標準品濃度依次為1.73×108、1.73×107、1.73×106、1.73×105、1.73×104、1.73×103copies/μL。曲線較光滑，為典型的“S”形曲線，各循環閾值(cycle threshold，簡稱CT值)間隔均勻。

梯度稀釋樣品熔解曲線如圖3所示，曲線峰值單一，峰值出現在84.73 ℃，表明擴增反應產物特異性良好且無引物二聚體影響。

標準曲線結果如圖4所示，縱坐標是CT值，橫坐標是 lg(拷貝數/μL)，斜率為-3.365，擴增效率E=(10-1/斜率-1)×100%=(10-1/-3.365-1)×100%=98.233%，相關系數r=0.999 9，截距為37.624。

綜合上述引物檢測、擴增曲線、熔解曲線和標準曲線的結果，可以確定建立的菌株PPZ-1實時熒光定量PCR檢測體系及反應條件合理可靠。

2.3 實時熒光定量PCR法的應用可行性

已有學者采用實時熒光定量PCR檢測環境樣品中的有機污染物降解菌。Tay等利用特異性16S rDNA引物擴增2種甲苯降解菌(自養黃色桿菌、分枝桿菌)，構建實時熒光定量PCR方法檢測污染水中的目標菌數量[16]。王金玉等以功能酶基因鄰苯二酚1，2雙加氧酶的基因序列為目標序列，構建實時熒光定量PCR方法，定量檢測苯胺降解菌在苯胺廢水生物強化序批式活性污泥系統中的豐度變化[17]。目前，尚未見嚴格區分土著降解菌和外源降解菌的研究。對土壤中的外源降解菌進行絕對定量的關鍵，在于找到該菌株與土著降解菌、土著同種屬菌具有差異的特異性基因序列設計引物，排除土著菌的干擾，同時還要保證其擴增結果的準確性。

由表2可知，本試驗的定量檢測方法所檢測出的2種土壤中多環芳烴降解菌PPZ-1的數量與理論投加量的數量級相同，且對照土壤中檢測不到該菌存在，說明該檢測方法能夠有效排除土著菌的干擾，準確、特異地檢測出土壤中菌株 PPZ-1 的數量，從而可以為改進修復時菌劑的投加量和投加方式提供理論指導。

表2 土壤中PPZ-1菌株的數量

注：ND表示未檢測到。

3 結論

本研究針對外源多環芳烴降解菌PPZ-1，基于基因組測序結果，篩選出了適于實時熒光定量PCR檢測的特異性基因序列和引物。所篩選的特異性引物在菌株中可以擴增出條帶，在土壤樣品相同位置無明顯條帶，具有較好的特異性。

以含有特異性基因序列的重組質粒為標準品，確定實時熒光定量PCR反應試驗條件，建立標準曲線。標準曲線相關系數為0.999 9，斜率為-3.365，擴增效率為98.233%，熔點曲線無雜峰。實時熒光定量PCR檢測體系及反應條件合理可靠。

將該檢測方法應用于投加了PPZ-1菌株的多環芳烴污染土壤，驗證其可行性。對污染土壤中的菌株PPZ-1進行絕對定量檢測，檢測值與理論值數量級相同，說明該檢測方法能夠有效排除土著降解菌、土著同種屬菌以及其他土著菌的干擾，準確、特異地檢測出土壤中菌株PPZ-1的數量，從而可以為改進修復時菌劑的投加量和投加方式提供理論指導。

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