HBx抑制RASSF1A表達參與肝細胞癌發生的可能機制

宋蘊薇，仇雪梅，陸森，樊紅

(1. 東南大學醫學院 遺傳與發育生物學系，江蘇 南京 210009； 2. 江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京210028； 3. 棗莊市婦幼保健院，山東 棗莊 277100； 4. 江蘇省人民醫院，江蘇 南京 210029)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)慢性感染是我國HCC重要的致病因素之一[1]。HBx基因是HBV病毒基因組中最小的開放性閱讀框，其蛋白作為多功能蛋白，廣泛參與病毒的復制、宿主細胞的基因調控和表達等過程[2]。在HBx致肝癌發生的研究中發現，HBx可以通過上調DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的表達使抑癌基因的啟動子區發生甲基化從而抑制其表達[3]。

RAS相關結構域家族1A(RASSF1A)是近年發現的一個重要抑癌基因。其啟動子區DNA甲基化引起的基因失活，與多種癌癥的發展有關[4-6]。HBx可能通過激活DNMT1的表達[7]，造成RASSF1A啟動子區DNA甲基化狀態改變致其失活，參與肝癌的發生和發展。本研究分析了肝細胞永生化細胞系及HCC細胞系中HBx的表達水平與RASSF1A基因表達水平之間的相關性，進而分析HBx對RASSF1A表達抑制的可能機制以及RASSF1A基因的低表達是否受其啟動子區甲基化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系

正常肝細胞永生化細胞系L02、Chang liver，HCC癌旁細胞系QSG-7701，HCC細胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2，穩定轉染HBV病毒的HCC細胞系HepG2.2.15，穩定轉染HBx基因的正常肝細胞永生化細胞系L02-X1#1、L02-X1#8及轉染空白載體的對照細胞系L02-TR#19。

1.2 RT-PCR及qPCR

抽提細胞系的總RNA，以制備cDNA第一鏈，進行PCR擴增，所用引物如下：β-肌動蛋白：正向引物5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，反向引物5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′；RASSF1A：正向引物5′-TCATCTGGGGCGTCGTG-3′，反向引物5′-CGTTCGTGTCCCGCTCC-3′；HBx：正向引物5′-GACGTCCTTTGTCTACGTCC-3′，反向引物5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′;DNMT1：正向引物5′-CCGAGTTGGTGATGGTGTGTAC-3′，反向引物5′-AGGTTGATGCTGCGTGGTAGC-3′。

1.3 轉染細胞系

HCC癌旁細胞系QSG-7701、HCC細胞系SMMC-7721中轉染HBx基因構建細胞模型QSG-7701-X1(轉染了HBx全長基因表達載體)、QSG-7701-X2(轉染了HBx截短序列表達載體)、轉染空白載體的對照細胞系QSG-7701-空白對照、SMMC-7721-X1(轉染了HBx全長基因表達載體)、SMMC-7721-X2(轉染了HBx截短序列表達載體)及轉染空白載體的對照細胞系SMMC-7721-空白對照；建立穩定轉染DNMT1 siRNA載體的HCC細胞系SMMC-7721-DNMT1 siRNA，及其對照細胞系SMMC-7721-DNMT1。

1.4 DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜胞苷(5′-aza)處理細胞

將攜有HBx基因的HCC細胞系MHCC-97H培養至匯合率30%時，分別以含有0、5、10、25及50 μmol·L-1的5′-aza RPMI 1640培養基繼續培養48 h后，更換為正常的培養基培養24 h使細胞回復生長。

1.5 亞硫酸氫鹽基因組測序(bisulfite genomic sequencing, BGS)

將用亞硫酸氫鹽法修飾純化過的DNA為模板，以半巢氏PCR方式擴增，引物分別為：MU379：5′-GTTTTGGTAGTTTAATGAGTTTAGGTTTTTT-3′； ML730：5′-ACCCTCTTCCTCTAACACAATAAAACTAACC-3′；ML561：5′-CCCCACAATCCCTACACCCAAAT-3′。其中MU379和ML730行第1輪PCR擴增，MU379和ML561行第2輪PCR擴增。擴增的PCR產物連接轉化入感受態的DH5α大腸桿菌中，挑取單克隆菌落，培養后進行菌液PCR，取8個陽性克隆過夜培養后菌液送華大基因公司測序。

2 結 果

2.1 RASSF1A在HCC細胞系中表達水平分析

在正常肝細胞永生化細胞系L02、Chang liver，HCC癌旁細胞系QSG-7701，HCC細胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2與HepG2.215中，應用RT-PCR與qPCR方法檢測RASSF1A的表達水平。結果發現，與正常肝細胞永生化細胞系L02、Chang liver和HCC癌旁細胞系QSG-7701相比，RASSF1A在HCC細胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2和HepG2.215中的表達水平明顯降低，且在MHCC-97H、MHCC-97L和HepG2.215細胞中均可檢測出HBx的表達(圖1A、B)。

圖1RASSF1A及HBx基因在HCC細胞系中的表達分析
A.qPCR方法檢測RASSF1A在HCC細胞系中的表達水平； B.RT-PCR結果顯示RASSF1A及HBx在HCC細胞系中的表達水平

Fig1ExpressionanalysisofRASSF1AandHBxinHCCcelllines

2.2 HBx基因表達載體的轉染抑制了RASSF1A基因的表達

與轉染對照空載體的L02-X1#19細胞系相比，RASSF1A在轉染HBx基因全長表達載體細胞系L02-X1#8中表達水平下降(圖2A)。在轉染HBx基因全長的細胞系QSG-7701-X1、SMMC-7721-X1及轉染HBx截短序列的細胞系QSG-7701-X2中，RASSF1A的表達水平亦存在下降趨勢(圖2B)。

圖2HBx基因的導入影響了RASSF1A的表達水平
A.轉染HBx表達載體的L02細胞系中RASSF1A的表達變化； B.轉染HBx表達載體的QSG-7701和SMMC-7721細胞系中RASSF1A的表達變化

Fig2ThetransformationofHBxaffectedtheexpressionlevelofRASSF1A

2.3 DNA甲基轉移酶抑制劑5′-aza使RASSF1A基因出現回復表達

為了檢測HCC細胞中RASSF1A的表達水平是否受DNA甲基化的影響，本研究在表達HBx基因的HCC細胞系MHCC-97H中行濃度梯度式5′-aza處理。提取處理組總RNA，以RT-PCR檢測RASSF1A表達水平，結果顯示，MHCC-97H細胞系中，5′-aza的處理升高了RASSF1A的表達水平，且表現為RASSF1A的表達水平與5′-aza的處理劑量的依賴關系(圖3A)。

圖3干預DNA甲基化轉移酶的表達與活性影響了RASSF1A的表達水平
A.RT-PCR檢測MHCC-97H細胞系在5′-aza處理后RASSF1A的表達情況； B.在DNMT1敲低的SMMC-7721細胞系中分析RASSF1A的表達變化

Fig3InterferenceofDNAmethyltransferasesexpressionandactivitychangedtheexpressionlevelofRASSF1A

2.4 敲低DNMT1能夠誘導RASSF1A的表達

由于DNA甲基轉移酶抑制劑5′-aza主要作用于DNMT1，本研究在轉染DNMT1 siRNA及其對照載體的HCC細胞系SMMC-7721中，應用RT-PCR檢測了RASSF1A表達水平的變化，結果發現，在DNMT1表達抑制的細胞系中，RASSF1A的表達水平升高(圖3B)。

2.5 DNMT1參與調控RASSF1A啟動子區DNA甲基化狀態

運用BGS及半巢氏PCR擴增DNMT1抑制前后細胞中RASSF1A啟動子區，行克隆測序分析。利用DNA甲基化分析軟件BiQAnalyzer分析所克隆序列中CpG位點甲基化變化情況，所檢測區域中包含16個CpG位點(圖4)。16個CpG位點總的測序結果分析顯示，DNMT1的抑制沒有明顯改變RASSF1A啟動子區的甲基化程度(P>0.05)。RASSF1A啟動子區序列16個CpG位點經轉錄因子結合位點在線預測軟件TFSEARCH預測其轉錄因子結合情況，發現第8、9個CpG位點和第14個CpG位點存在轉錄因子Sp1和USF結合的核苷酸序列(圖4)。這些CpG位點在DNMT1抑制的細胞系SMMC-7721-DNMT siRNA中呈半甲基化狀態，在其對照細胞系SMMC-7721-DNMT1對照組中呈完全甲基化狀態。

圖4BGS檢測SMMC-7721-DNMT1siRNA細胞系及其的對照細胞中RASSF1A啟動子區DNA甲基化狀態變化

Fig4CpGsitesmethylationstatusoftheRASSF1ApromoterregionwasdetectedbyBGSinSMMC-7721celllinesthatknockdownDNMT1andthecontrolcells

3 討 論

本研究發現，在HCC細胞系中，RASSF1A的表達水平明顯低于正常肝細胞永生化細胞系及癌旁細胞系。該結果與前期文獻中所報道的RASSF1A在HCC細胞系中的表達變化情況[8]一致，提示RASSF1A失活在肝癌的發生中可能發揮一定作用。此外，我們的研究還發現，在表達HBx的HCC細胞系MHCC-97H、MHCC-97L及HepG 2.215中，RASSF1A表達水平降低，暗示了RASSF1A的表達可能受HBx的影響。進一步研究發現，正常肝細胞永生化細胞系L02、HCC癌旁細胞系QSG-7701和HCC細胞系SMMC-7721中轉染HBx基因使RASSF1A的表達水平也均有下降，提示HBx抑制了抑癌基因RASSF1A的表達，可能是HBx致HCC發生的分子機制之一。

在HCC中RASSF1A的啟動子區DNA異常甲基化比率達到了80%以上[9]，啟動子區DNA的異常甲基化被認為是RASSF1A失活的主要機制?；诖耍狙芯堪l現轉染了HBx之后RASSF1A的表達水平均有所下降。以往研究顯示，HBx可以誘導DNMT1的表達[10]，提示HBx影響RASSF1A的表達可能與DNMT1有關。我們在研究中發現，抑制DNMT1后RASSF1A的表達水平有所回復，提示RASSF1A的表達受DNMT1的調控。隨后研究發現，DNMT1調節了RASSF1A啟動子區DNA的甲基化狀態，尤其改變了RASSF1A啟動子區轉錄因子Sp1和USF結合位點的甲基化程度。Sp1是屬于Sp/KLF家族的一類轉錄因子，由785個氨基酸構成，分子質量為100～110 kDa[11]；它可與DNA直接結合并增強基因的轉錄，其異常表達與多種腫瘤的發生發展有關[12]。USF是一類HLH(Helix-Loop-Helix)結構的轉錄因子，可以通過二聚體的形式與DNA結合，增強基因的轉錄活性[13]。USF是一種在細胞質中廣泛分布的轉錄因子，在黑色素瘤中USF表達增強[14]。而CpG位點的甲基化可抑制USF與DNA序列的結合，進而使下游基因表達下調[15]。啟動子區結合位點的DNA甲基化有可能對以上兩種轉錄因子和DNA的結合產生抑制，從而導致RASSF1A表達的下調。

綜上所述，在肝細胞及HCC細胞系中，HBx可能通過上調DNMT1的表達，進而改變RASSF1A的啟動子區DNA甲基化狀態以調控其表達。DNMT1影響RASSF1A啟動子區DNA甲基化程度主要集中在其啟動子區轉錄因子Sp1和USF結合位點，其具體機制尚需進一步探究。除此之外，HBx亦可能通過miRNA影響RASSF1A的表達[16]。盡管如此，DNMT1可能還存在其他途徑調節RASSF1A的表達，尚需進一步的研究。

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