IGF-1對多發性抽動癥模型大鼠紋狀體神經元氨基酸遞質水平及細胞凋亡的影響

伍俊伊，曾曉云

(武漢市普愛醫院 神經內科，湖北 武漢 430030)

小兒多發性抽動癥(tourette syndrome，TS)是以發音異常和多種運動為特征的人類神經障礙性疾病。臨床表現為不自主的、無目的的單一或多部肌群的收縮，如眨眼、皺眉、搖頭、聳肩等運動[1]。目前該病的病因和發病機制尚未明確，皮質-紋狀體-丘腦-皮質回路中神經遞質失衡一直是學者們探索的主流方向，多數學者認為多巴胺(DA)系統功能異常及相關遞質(受體)表達失衡可能是其主要發病機制，但隨著研究的深入，逐漸發現氨基酸類遞質與TS的發生密切相關[2]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)可減緩肌萎縮側索硬化癥病情惡化[3]。IGF-1對戊四唑誘導的幼年大鼠癲癇持續狀態具有明顯的神經保護作用，可抑制神經細胞凋亡，并促進增殖[4]。研究表明，TS患兒血清IGF-1含量顯著下降，且可作為其診斷的輔助檢測指標[5]。本研究探討IGF-1對TS模型大鼠紋狀體神經元內氨基酸遞質水平及細胞凋亡的影響，以期為TS的臨床治療和藥物研發提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠24只，體重(220±30)g，購自華中科技大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(鄂)2015-0007，動物實驗遵循《關于善待實驗動物的指導下意見》的相關規定。大鼠分籠飼養，實驗前實驗性飼養1周，室溫(22±2)℃，濕度50%～70%，通風，晝夜節律為12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.1.2 實驗試劑 亞氨基二丙腈(IPDN)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、四硼酸鈉、鄰苯二甲醛購自美國Sigma公司，重組IGF-1購自美國Chemicon公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，核轉錄因子-κB(NF-κB)、半胱天冬酶-3(caspase-3)一抗購自南京碧云天生物技術公司，GAPDH一抗、兔抗鼠二抗購自武漢博士德公司，磷酸氫二鈉、高氯酸、無水甲醇等均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 24只大鼠按照隨機數字表法均分為3組：對照組大鼠注射與各組藥物等體積的生理鹽水；模型組大鼠注射腹腔注射IPDN，劑量為350 mg·kg-1，每天1次，連續給藥7 d；治療組大鼠先腹腔注射IPDN，劑量及時間與模型組一致，第7天注射完后6 h再注射重組IGF-1 1次，劑量為0.1 mg·kg-1。IGF-1采用腦立體定位注射，藥物使用生理鹽水稀釋至終濃度為6 μg·μl-1，大鼠經水合氯醛麻醉后固定于腦立體定位儀，按腦立體定位圖譜用微量注射器注射，注射完后停針15 min，縫合傷口，繼續喂養7 d。

1.2.2 TS模型建立判斷 大鼠腹腔注射IPDN造模7 d后，模型鼠均出現不同程度的刻板行為(頭部抽動、旋轉運動)和運動行為(探究活動增加)，尤其刻板行為表現明顯且易分辨，提示TS大鼠模型建立成功。

1.2.3 刻板運動評分 分別于給藥后即刻及3、5、7 d對大鼠進行行為學檢測，參照Khan等[6]的方法并加以改進。將大鼠放置于單獨的觀察籠內，室內環境安靜、避光，適應5 min后使用數碼攝錄機進行大鼠行為的攝像，同時采用雙盲法對大鼠刻板運動進行評分，評分時間為2 min，具體標準：無刻板運動記0分，有旋轉行為記1分，頭部垂直運動記2分，頭部垂直運動和旋轉行為記3分，頭側擺伴頭部垂直運動記4分。取兩人評分的平均值并記錄結果。

1.2.4 高效液相色譜法測定紋狀體內Glu、GABA含量 將大鼠在最后一次給藥24 h后斷頭處死，快速分離出紋狀體，用干凈鋁箔包好置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存。稱取紋狀體組織30～50 mg，加0.35 ml預冷的勻漿工作液，冰浴下使用電動微量勻漿器快速勻漿，靜置10 min，4 ℃下14 000×g離心15 min，取上清液，用離心式過濾器7 000 r·min-1離心過濾，再用0.05 mol·L-1高氯酸10倍稀釋，取20 μl放入自動進樣器中待測。色譜條件：預柱為Shiseido，Guard Cartridge，Capcell C18 MG S-5，4.0 mm×10 mm；色譜柱：Waters XterraTM MS(3.0 mm×50 mm，2.5 μm)；流動相為100 mol·L-1磷酸氫二鈉，25%甲醇，10%乙腈，用磷酸調pH至6.70；流速：0.6 ml·min-1；衍生方法：取50 μl OPA/β-巰基乙醇加入到20 μl稀釋后的紋狀體組織勻漿液中，衍生2 min后上樣，進樣量為20 μl，柱溫40 ℃，設置2道電勢為150和550 mV。

1.2.5 蛋白印跡法檢測NF-κB、caspase-3蛋白的表達 使用細胞蛋白裂解液將紋狀體組織充分裂解完全，離心后吸取上清，采用BCA法測定總蛋白濃度，小管分裝后加上樣緩沖液，沸水浴使蛋白高溫變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，半干電轉移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉，NF-κB、caspase-3、GAPDH一抗孵育4 ℃過夜，洗膜后二抗孵育，洗膜后暗房顯影。蛋白表達半定量采用條帶灰度分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 刻板運動評分比較

對照組大鼠各個時間點均無刻板運動發生，模型組和治療組大鼠各個時間刻板運動評分詳見表1。與模型組相同時間比較，治療組大鼠IGF-1處理后5、7 d的刻板運動評分顯著減少(P<0.05)。

表1模型組與治療組大鼠給藥后不同時間點的刻板運動評分

組 別n不同時間點刻板運動評分0 d3 d5 d7 d模型組82.48±1.162.32±1.212.57±1.252.63±1.49治療組82.53±1.242.06±1.351.41±0.831.07±0.72t值0.0830.4062.1872.666P值0.9350.6910.0460.018

2.2 紋狀體Glu、GABA含量比較

與對照組比較，模型組大鼠紋狀體Glu、GABA含量顯著上升(分別t=5.037、t=4.855，均P<0.05)，治療組紋狀體Glu、GABA含量也顯著上升(分別t=2.759、t=2.622，均P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠IGF-1處理后紋狀體Glu、GABA水平明顯降低(分別t=2.457、t=2.213，均P<0.05)。見表2。

表2各組大鼠給藥后紋狀體內Glu和GABA含量

μg·g-1

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

2.3 紋狀體組織NF-κB、caspase-3蛋白表達

與對照組比較，模型組大鼠紋狀體NF-κB、caspase-3蛋白表達水平顯著上調(均P<0.05)，治療組紋狀體NF-κB、caspase-3蛋白表達水平也顯著上升(均P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠IGF-1處理后紋狀體NF-κB、caspase-3蛋白表達水平明顯下降(均P<0.05)。見圖1。

3 討 論

TS發病與DA、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素等神經遞質系統失衡有關[1]。目前研究表明，腦內氨基酸類神經遞質異?？赡軈⑴cTS發展[2]。TS患者腦內Glu水平升高使中樞神經系統呈過度興奮狀態，抑制Glu過度釋放可有效改善TS及其合并癥發生[7]。TS病人血清GABA含量升高，推測GABA參與TS發展[8]。本研究結果顯示，模型組大鼠紋狀體內Glu和GABA含量與對照組比較顯著上升，與上述報道結果一致，說明TS發病與腦內氨基酸遞質水平異常有關。

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

圖1各組大鼠紋狀體凋亡相關蛋白NF-κB、caspase-3表達情況

IGF-1又稱生長調節素C，與機體組織修復、神經保護等有關[9-10]。研究表明，運動神經障礙患者腦脊液中IGF-1含量較之健康對照者明顯減少[11]；帕金森病患者血清IGF-1水平也顯著低于健康對照組[12]；皮質下缺血性腦血管病患者血清IGF-1水平明顯降低，且與認知功能損害呈正相關。本研究結果顯示，腦內注射給予IGF-1能夠抑制TS大鼠刻板運動行為的發生，降低紋狀體內氨基酸遞質Glu和GABA的含量，延緩TS癥狀發展，但確切的作用分子機制有待將來更深入的研究。

IGF-1受體廣泛分布于人體各組織器官，在中腦黑質紋狀體區DA能神經元中亦有表達。多項研究發現，IGF-1具有神經保護作用；IGF-1可抑制左旋多巴對神經細胞的凋亡誘導作用[13]；IGF-1基因敲除小鼠紋狀體微白蛋白神經元嚴重脫失[14]。研究表明，IGF-1抑制細胞凋亡與減少促凋亡因子caspase-3合成、降低Bax/Bcl-2之值、減少細胞色素C釋放等相關[15-16]。本研究結果表明，IGF-1可通過抑制caspase-3、NF-κB蛋白表達對TS紋狀體神經元具有一定的保護作用。

綜上所述，IGF-1對TS大鼠紋狀體神經元具有一定的保護作用，機制可能與其下調紋狀體內氨基酸遞質水平及凋亡蛋白表達有關。

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